大肠癌中EGFR、cerbB2及VEGF的表达与临床病理特征的关系

作者：杜伟    作者单位：200070 上海，第二军医大学附属长征医院肿瘤科, 2. 病理科 　　【摘要】  目的 研究EGFR、cerbB2和VEGF在大肠癌中的表达及其与临床病理特征的关系。方法 应用免疫组化Envision方法检测61例大肠癌组织中EGFR、cerbB2及VEGF的表达水平。以多重线性回归分析上述基因表达水平与临床病理特征的关系。结果 61例大肠癌中EGFR、cerbB2和VEGF的阳性表达率分别为49.2%（30/60）、73.8%（45/61）和70.5%（43/61）, 多因素分析显示它们分别与肿瘤大小，淋巴结、肝脏转移及Dukes分期相关，而与病人的性别和年龄无关。结论 EGFR、cerbB2及VEGF可作为临床判定大肠癌恶性程度及评估预后的指标，对指导术后化疗或靶向治疗具有一定的意义。

　　【关键词】  EGFR cerbB2 VEGF 大肠癌 免疫组化

　　大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一,每年全世界约有50万人发病,在西方国家大肠癌死亡率仅次于肺癌和乳腺癌,居恶性肿瘤死亡率第3位；1990～1992年中国1/10人口死因抽样调查结果显示,中国大肠癌的年死亡率为5.30/10万,居恶性肿瘤死因第5位。根据患者的肿瘤大小、临床分期、淋巴结状态、肿瘤组织学分级等指标来判断病情发展及预后已得到广泛应用。但近年随分子生物学迅速发展，一些蛋白质分子生物标记应用于恶性肿瘤的预后判断[1]。本实验应用免疫组化方法检测大肠癌中EGFR、cerbB2及VEGF的表达，旨在进一步探讨它与大肠癌的临床病理特征的关系，为大肠癌的诊断、治疗及预后判断提供客观的参考指标。

　　1  资料与方法

　　1.1  临床资料

　　收集上海市长征医院2002年12月～2003年12月的大肠癌手术标本61例，经10%中性福尔马林固定后，常规石蜡包埋切片。其中男34例，女27例，年龄26～83岁，平均年龄56.9岁。按Dukes分期，A+B期20例，C+D期41例；有淋巴结转移23例，无淋巴结转移38例；有肝转移4例，无肝转移57例；高分化2例，中分化53例，低分化6例；肿瘤

　　大小≤5cm  40例，＞5cm  21例。

　　1.2  试剂

　　（1）鼠抗人cerbB2/HER2/原癌基因蛋白单克隆抗体（上海长岛生物技术有限公司产品，产品编号：R0196；克隆号：e24001+3B5）; （2)抗人EGFR单克隆抗体（福州迈新生物技术开发有限公司产品，产品编号：MAB0196；克隆号：EGFR/113）；（3）抗人VEGF单克隆抗体（福州迈新生物技术开发有限公司产品，产品编号：MAB0243；克隆号：JH121）。

　　1.3  方法及分级标准

　　采用免疫组化Envision法。主要步骤：(1) LLysine处理玻片;(2)连续石蜡切片4μm,60℃烘干1h;(3)常规脱蜡、水化组织切片；(4)预处理组织切片；(5)切片用蒸馏水洗1×3min，PBS洗2×3min;6.3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，孵育10min；(7)PBS洗3×3min;(8)滴加第一抗体，置湿盒内4℃过夜；(9)PBS洗3×3min;(10)滴加EnvisionTM孵育30min；(11)TBS洗3×3min;(12)DAB显色5～10min;(13)苏木精复染，常规脱水透明、中性树脂封片。

　　染色结果判定：细胞膜或胞浆呈淡棕色为1分，棕黄色2分，棕褐色3分；阳性细胞数≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～74%为3分，≥75%为4分；染色的评分与阳性细胞数评分相加，0～1分（-），2～3分（+），4～5分（++），6～7分（+++）；最后得分以4～7分为高表达。

　　1．4  统计学方法

　　采用SPSS13.0统计分析软件，分别以cerbB2、EGFR、VEGF为应变量，以肿瘤大小、淋巴结转移、肝脏转移、Dukes分期、性别、年龄为自变量进行多重线性回归分析。

　　2  结果

　　2.1  cerbB2、EGFR、VEGF在大肠癌中的表达

　　61例大肠癌中45例（73.8%）cerbB2阳性表达，其主要分布于上皮细胞膜，见图1；在恶性组织中呈阳性表达而临近的正常组织呈阴性表达，见图2；61例大肠癌中30例（49.2%）EGFR阳性表达，其主要分布于上皮细胞膜，见图3；61例大肠癌中43例(70.5%)VEGF阳性表达，其主要分布于上皮细胞的胞浆，见图4。

　　2.2  cerbB2、EGFR、VEGF的表达与大肠癌临床病理特征的关系

　　按α=0.10水准，在3种分析中性别、年龄被剔除，共引入肿瘤大小、淋巴结转移、肝脏转移、Dukes分期等4个变量。各偏回归系数见表1。表1  4个自变量的偏回归系数值表用逐步回归法筛选变量，按α=0.10水准，在以上的3种分析中性别、年龄被剔除，共引入肿瘤大小、淋巴结转移、肝脏转移、Dukes分期等4个变量，对各偏回归系数进行统计学检验，t值均大于查表所得t值1.671，见表2，故Ｐ<0.10，可认为 cerbB2、EGFR及VEGF三者在大肠癌中的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、肝脏转移及Dukes分期有关,而与性别、年龄无关。表2  3组分析中，4个自变量的 偏回归系数b经假设检验的t值表

　　3  讨论

　　EGFR属于erbB酪氨酸蛋白激酶家族，该家族的成员包括erbB1、2、3和4。erbB1也称为EGFR，

　　图1  大肠癌组织中cerbB2阳性表达      图2  cerbB2在恶性组织及临近正常组织中的表达

　　图3  大肠癌组织中EGFR表达阳性图4  大肠癌组织中VEGF表达阳性 （均用Envision法×300）

　　是具有酪氨酸激酶活性的erbB家族的典型成员之一，能够被配体激活[2,3]。EGFR主要自主结合配体有EGF和TGFα，它们是许多肿瘤中包括胃肠道肿瘤DNA合成和细胞生长的主要催化剂，EGFR能与EGF及TGFα等有效结合，引起细胞增生；在一定条件下，EGFR可能存在自身激活从而导致细胞的异常增生，并在细胞的恶性转化中发挥重要作用[4]。

　　研究证实，EGFR的表达和激活在恶性增殖中起作用[5,6]，且通过对细胞骨架的重构、黏附、移动、表达及蛋白脂酶的活化等多种机制在肿瘤转移中起重要作用[7]。已有研究提示EGFR在结肠癌中过表达可能与疾病病程晚有关[8]，另外EGFR蛋白的表达还与肿瘤的分级及肿瘤的侵袭性相关[9,10]，并与肠系膜淋巴结转移率高有关[11]。

　　本研究结果显示，大肠癌组织中的EGFR阳性表达率为49.2%(30/61), EGFR的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、肝脏转移及Dukes分期相关，且相关性由大到小的是肿瘤大小、Dukes分期、肝脏转移、淋巴结转移。在肿瘤病灶大、分期晚、有肝脏转移或有淋巴结转移的肿瘤组织中，EGFR的表达高于病灶小、分期早、无肝脏转移或无淋巴结转移者。提示EGFR高表达的肿瘤可能具有更强的侵袭性。

　　正常情况下cerbB2基因处于非激活状态，又称原癌基因，参与细胞生长分化的调节。cerbB2和EGFR有近50%的同源性，同属I型生长因子受体家族，在结构和功能上均相似，可以接受EGF样物质的信息，刺激细胞增殖，具有酪氨酸激酶的活性。当受到体内外某些因素作用后，其结构或表达调控失常从而被激活，具有肿瘤转化活性。研究证实，鸟红细胞增多症病毒的cerbB2原癌基因产物与EGFR的酶解肽段几乎完全一致，它在无配体存在的情况下，可持续激活EGFR的蛋白激酶，使细胞生长失控。

　　本实验中cerbB2阳性表达率为73.8%(45/61)，且 cerbB2的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、肝脏转移及Dukes分期相关。从结果中看出，cerbB2基因在肿瘤生长，转移的过程中也起着一定的作用，但目前相关研究还不多，还需更进一步实验来证实。

　　VEGF是迄今所发现的最重要的促血管生成因子， 本研究结果为61例大肠癌组织中VEGF阳性表达率为70.5%(43/61)，VEGF的表达与肿瘤大小、肝脏转移、淋巴结转移及Dukes分期相关。随着肿瘤的增大，肝脏的转移，淋巴结转移及Dukes分期的提高，VEGF阳性率随之升高，这表明VEGF可能与大肠癌的发生、浸润、转移密切相关，其表达愈强，大肠癌的侵袭性越强，提示VEGF可作为反应大肠癌生物学行为的指标。其发生原因可能与VEGF可以诱发新生血管形成，这对肿瘤的生长，浸润及转移有重要的作用。

　　以上3个基因的表达与大肠癌的病理学特征关系并不是简单的线性累积关系，在某一特定阶段，可能起着主导作用或者有协同作用，但还需进一步研究证实。

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