蛋白酶活化受体1在鼻咽癌中的表达及意义

作者：皮国良    作者单位：430023 武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心 【摘要】  目的 检测PAR1在鼻咽癌中的表达,探讨PAR1在鼻咽癌中表达的意义。方法 免疫组织化学（SP法）检测28例良性鼻咽组织、61例鼻咽癌组织中PAR1中的表达；采用RTPCR、Western Blot检测鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2中PAR1表达并比较其表达差异。结果 PAR1在鼻咽癌组织及两种鼻咽癌细胞株中均表达。PAR1在28例良性鼻咽组织表达为10例，61例鼻咽癌组织中表达48例。PAR1在鼻咽癌组织中的表达率明显高于在良性鼻咽组织中的表达率（Ｐ<0.01），高度恶性细胞株中PAR1的表达明显高于其低度恶性细胞株。结论 PAR1的表达与鼻咽癌的发生、生长方式、分期、恶性程度等有关。PAR1在鼻咽癌中的表达可能介导鼻咽癌侵袭转移等恶性生物学行为。

【关键词】  鼻咽癌 蛋白酶活化受体 转移

    鼻咽癌是我国常见恶性肿瘤之一，极易发生侵袭转移，远处转移是其治疗失败的主要原因。目前认为，癌基因异常激活和抑癌基因监控失活在鼻咽癌侵袭转移等恶性生物学行为中起着重要作用，阐明上述机制，是控制鼻咽癌的关键。蛋白酶活化受体家族PARs（protease－activated receptors）是介导血栓形成的一种G蛋白耦联受体，PARs家族有4 种亚型,PAR1是其中研究最为深入的一种。PAR1表达于人多种正常细胞，在调节血栓形成、细胞粘附和迁移、整合素的衔接、有丝分裂、介导过敏等多种病理生理过程中发挥作用。新近研究发现PAR1在多种恶性肿瘤（如肺癌、乳腺癌、前列腺癌等）中也高表达PAR1，而且这种表达与肿瘤侵袭转移等生物学行为密切相关。PAR1在人鼻咽癌这一高度恶性高侵袭性的肿瘤中的表达未见文献报道。本实验首次对人鼻咽癌组织及细胞系中的PAR1表达进行研究,并探讨PAR1的表达在人鼻咽癌中的意义。

    1  资料及方法 

    1.1  标本及临床病理资料

    收集武汉协和医院耳鼻喉科门诊2006年12月～2007年9月期间的鼻咽部活检标本共89例，均为初治患者，所有标本均经光镜HE染色后病理学诊断：其中鼻咽良性病变28例，鼻咽癌61例。肿瘤生长模式按照显微镜下NPC 癌细胞生长方式分为三型[1]即: 癌细胞巢状膨胀性生长为主的Regaud型,癌细胞弥漫性浸润性生长为主的Schminke型,癌细胞既膨胀性又浸润性生长的Combination混合型。

    1.2  药物和试剂

    细胞培养试剂购自Gibco公司，Trizol (Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(K1621)由武汉晶美公司代理购自Fermentas公司。PAR1鼠抗人单克隆抗体(购自Santa  Cruz  Biotechology,sc13503)。SP Kit、HRP标记羊抗鼠IgG购自、DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。蛋白裂解液购自PIERCE公司。

    1.3  细胞培养

    人鼻咽高分化鳞癌细胞株CNE1、低分化鳞癌细胞株CNE2由华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室馈赠。细胞培养选用含有10％新生牛血清的RPMI1640培养液，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养。待细胞长满培养瓶底部70％～80％时，用含0.02%  EDTA的胰蛋白酶消化传代，取对数生长期用于实验。

    1.4  RTPCR检测鼻咽癌细胞株中的PAR1mRNA的表达

    用Trizol从细胞中提取总RNA并逆转录成cDNA。设计引物序列(上海生工)，见表1。PCR仪进行相应基因扩增。反应体系为：2.5μl的10×PCR缓冲液(含Mg2＋)，2μl  cDNA，1μl dNTPs(2.5mmol／L)，上下游引物各0.5μl (10pmol/L)，Taq聚合酶0.5μl (5U/L )，用灭菌ddHO，补足至25μl。PCR循环参数为：94℃,5min，1个循环；94℃ 50s，59.8℃(PAR1)／56℃(βactin)  50s，72℃ 50s，35个循环；72℃ 10min终止反应。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯观察并照相。  表1   PAR1和内参βactin基因引物序列

    基因引物序列扩增长度PAR1上游：GTGCTGTTTGTGTCTGTGCT598bp下游：CCTCTGTGGTGGAAGTGTGAβactin上游： GGCGGCAACACCATGTACCCT202bp下游： AGGGGCCGGACTCGTCATACT

    1.5  Western Blot检测

    检测细胞株中PAR1蛋白表达，并比较两种细胞株中的表达差异：取对数生长期的CNE1、CNE2细胞各1×107/ml（约50ML培养瓶），蛋白提取: 用预冷的PBS 洗细胞3 次, 加入细胞裂解液400μl(900μl MemPER加入100μl  PMSF）裂解细胞，冰盒上刮下细胞,4℃、10000r/min离心10min,收集上清,－20℃保存，Bradford比色法测定蛋白浓度定量，调蛋白浓度一致后，行SDSPAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶粉37℃封闭1h，与鼠抗人PAR1一抗（1∶200稀释）4℃孵育过夜，用TBST洗涤3次，每次15min,后加入HRP标记羊抗鼠IgG（1∶5000稀释），37℃孵育1h后，用ECL发光试剂，暗室中曝光压片，检测蛋白质表达，胶片扫描保存。

    1.6  免疫组织化学（SP法）检测

    检测鼻咽癌标本及鼻咽良性标本中PAR1的蛋白表达并行亚细胞定位。标本处理：收集新鲜鼻咽部活检标本用0.9％生理盐水冲洗后立即置于100ml/L 甲醛固定24h，常规石蜡包埋，切片厚4μm，HE染色进行组织学分类。免疫组化SP法,具体步骤参照试剂盒说明书。空白对照以PBS取代一抗，阳性对照为已知阳性片。阳性判断标准：阳性染色呈棕黄色颗粒状，阴性对照无着色。对每例鼻咽部活检标本的PAR1表达情况与患者临床资料进行分析。

    1.7  统计学方法

    采用SPSS10.0软件进行分析，相关性分析采用χ2检验,定量分析采用均数±标准差(±s)表示，行t检验。

    2  结果

    2.1  两种鼻咽癌细胞株中PAR1的mRNA和蛋白的表达情况及其差异

    RTPCR检测到两种细胞株中均存在PAR1mRNA的表达, 两种鼻咽癌细胞株中的表达存在明显差异，其中低分化鳞癌细胞株CNE2中为高表达，高分化鳞癌细胞株CNE1为中等表达，见图1。Western Blot检测到两种鼻咽癌细胞株中存在PAR1蛋白表达，PAR1在CNE2中的表达明显高于PAR1在CNE1中的表达，见图2。

    2.2  免疫组化结果

    免疫组化示，PAR1主要表达于细胞膜，28例良性鼻咽组织表达为10（+），61鼻咽癌组织中48（+），鼻咽癌组织中PAR1表达率明显高于良性鼻咽组织（χ２＝15.219， P<0.01）。癌细胞膜上可见阳性染色的棕黄色颗粒（图略）。

    2.3  PAR1的表达与鼻咽癌患者临床参数的关系

    研究显示，PAR1在鼻咽癌中的表达与癌细胞

    图１  RTPCR显示两种细胞株中PAR1的表达

    图示两种鼻咽癌细胞株中存在PAR1蛋白表达，t检验得出PAR1在CNE2细胞株中的表达明显高于PAR1在CNE1细胞株中的表达（条带灰值：CNE1：0.34356686±0.149120837, CNE2：0.89469757±0.100732874, P＝0.188）

    图２  Western Blot显示两种细胞株

    中PAR1的蛋白表达及其差异

    的生长方式、局部淋巴结有无转移、TNM分期早晚相关（P<0.05），见表2。Schmincke型方式生长的鼻咽癌患者中PAR1的表达明显高于Regaud型,有局部淋巴结转移的患者,PAR1的表达高于无局部淋巴结转移患者，PAR1的表达率与原发肿瘤范围即T分期（但随T分期的提高表达率增加）无明显相关，但与TNM分期密切相关，分期越晚，PAR1的表达率越高。此外，男性患者中PAR1表达率稍高于女性患者，随着年龄的增高，PAR1的表达率也增高，但差异无统计学意义（P>0.05）。

    3  讨论 

    恶性肿瘤侵袭转移是其危害患者生命的主要原因，阻断恶性肿瘤的侵袭转移在恶性肿瘤的治疗中尤为关键。最新研究提示,PAR1在多种恶性肿瘤中高表达[2]。高表达的PAR1介导某些肿瘤的恶性生物学行为，主要是表现在许多肿瘤中与肿瘤的侵袭转移相关。在良性乳腺上皮及非侵袭性细胞株中PAR1的表达最低或无表达,而在侵袭性乳腺癌MDAMB21细胞株中则表达高水平的功能性PAR1[2]。Martin等[3]得出PAR1的表达水平与促进前列腺癌细胞的骨转移相关。

    目前认为，PAR1主要是作为某些介导恶性肿瘤侵袭转移的物质的受体而作用，主要是与凝血酶[4]、基质金属蛋白酶家族（MMPs）[5]、整合素家族[6]、血管生存[7，8]等相关。此外，研究发现PAR1还可能参与某些信号通路而与肿瘤形成[9]、分化[10]、凋亡逃避[11]、耐药[12]等也有关。

    表2  PAR1的表达与鼻咽癌患者临床参数的关系PAR1在恶性肿瘤侵袭转移等复杂生物学行为中的具体作用及调控机制远未被阐明，PAR1在许多肿瘤中的作用具有明显的特征性。不同类型肿瘤在肿瘤进展的不同期别，PAR1发挥的作用，值得深入研究。

    PAR1在鼻咽癌组织及细胞系中表达尚无文献报道,笔者首次采用免疫组织化学、Western Blot和RTPCR方法检测PAR1在鼻咽癌组织及细胞系中PAR1的表达。结果显示,鼻咽癌组织中PAR1的表达水平明显高于鼻咽部良性病变。61例鼻咽癌标本中，不同性别鼻咽癌患者的PAR1的表达无明显差异,年龄高低与PAR1的表达亦无明显相关。Schmincke型方式生长的鼻咽癌患者中PAR1的表达明显高于Regaud型，PAR1的表达和局部淋巴结转移相关,这说明PAR1的表达可能增强癌细胞侵袭，影响了癌细胞间的粘附性，使癌细胞容易相互分离并向间质移动，导致向周围邻近组织侵袭。此外，PAR1的表达率与原发肿瘤范围无明显相关，可能有待增加病例数证实,但与TNM分期密切相关，分期越晚，PAR1的表达率越高。低分化鳞癌细胞株CNE2中PAR1表达水平显著高于高分化鳞癌细胞株CNE1，病理组织学认为，分化程度越低的肿瘤细胞恶性程度越高，侵袭性越强，提示PAR1在鼻咽癌中的表达水平可能与鼻咽癌细胞恶性程度及侵袭力相关，这与PAR1在其他恶性肿瘤中的研究一致。

    综上，初步研究得出PAR1在鼻咽癌中的高表达与肿瘤的侵袭转移等恶性生物学行为相关。本研究尚待扩大标本数,进一步完善临床病理资料（如病理类型、治疗反应、预后）和结合细胞学功能实验,探讨PAR1的表达及其改变与鼻咽癌成瘤性侵袭转移等生物学行为的关系，为今后研究鼻咽癌的发生侵袭转移等机制并进行干预打下基础。

    (致谢：感谢武汉协和医院耳鼻喉科胡运梅护师，钟刚、陈沛、陈建军医师等在收集鼻咽部标本中给予的帮助。)

【参考文献】  ［1］ Shanmugaratnam K, Sobin LH. Histological typing of tumors of the upper respiratory tract and ear[M]. 2nd Ed. Berlin: SpringerVerlag,1991.3233.

[2] EvenRam S, Uziely B,Cohen P,et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological invasion processes[J].Nat Med,1998,4(8):909914.

[3] Martin CB,Mahon GM, Klinger MB,et al. The thrombin receptor,PAR1,causes transformation by activation of Rhomediated signaling pathways[J].Oncogene,2001,20(16) :19531963.

[4] Turcotte S,Desrosiers RR,Brand G,et al. Von HippelLindau tumor suppressor protein stimulation by thrombin involves RhoA activation[J]. Int J Cancer,2004,112(5) :777786.

[5] Boire A,Covic L,Agarwal A,et al. PAR1 is a matrix metalloprotease－1 receptor that promotes invasion and tumorigenesis of breast cancer cells[J]. Cell,2005,120(3) :303313.

[6] EvenRam SC,Maoz M, Pokroy E,et al. Tumor cell invasion is promoted by activation of protease activated receptor1 in cooperation with t he alpha v beta 5 integrin[J]. J Biol Chem,2001,276(14):1095210962.

[7] Liu J, SchuffWerner P, Steiner M. Thrombin/thrombin receptor (PAR1) mediated induction of IL8 and VEGF expression in prostate cancer cells[J]. Biochem Biophy Res Commun 2006,343(1):183189.

[8] Yin YJ,Salah Z,Maoz M,et al. Oncogenic transformation induces tumor angiogenesis : a role for PAR1 activation[J]. FASEB J,2003,17(2) :163174.

[9] Yin YJ，Katz V, Salah Z, et al. Mammary Gland Tissue Targeted Overexpression of Human ProteaseActivated Receptor 1 Reveals a Novel Link to BCatenin Stabilization[J]. Cancer Res， 2006,66(10): 52245233.

[10]Zhang X, Hunt JL, Chen Z, et al. Correlation of ProteaseActivated Receptor1 With Differentiation Markers in Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck and Its Implication in Lymph Node Metastasis[J].Clinical Cancer Research, 2004,10(24): 84518459.

[1１]Zaidoun S, Myriam M, Elisheva P, et al. ProteaseActivated Receptor1 (hPar1), A Survival Factor Eliciting Tumor Progression[J].Mol Cancer Res,2007,5(3):229240.

[1２]TantivejkulK,Loberg RD,Mawocha SC, et al. PAR1mediated NFkappaB activation promotes survival of prostate cancer cells through a BclxLdependent mechanism[J]. J Cell Biochem, 2005,96(3):641652.