PYK2在PGE2诱导大肠癌细胞侵袭转移中的作用
发表时间：2010-03-05 浏览次数：449次
PYK2在PGE2诱导大肠癌细胞侵袭转移中的作用作者：兰小琴, 王 莹，李美宁，张悦红，解 军，程牛亮 作者单位：太原，山西医科大学生物化学与分子生物学教研室 【摘要】 目的 研究富含脯氨酸的酪氨酸激酶 2(prolinerich tyrosine kinase 2，PYK2)在前列腺素E2(PGE2)诱导大肠癌SW480细胞侵袭转移中的作用。方法 实验分为A、B、C、D四组，分别为未处理组，PGE2组，PGE2+SC19220(EP1抑制剂)组，PGE2+BAPTAAM(胞内Ca2+螯合剂)组。通过 RTPCR检测SW480中PGE2四种EP(EP1,EP2,EP3,EP4)受体的表达，应用Western blotting检测SW480细胞中PYK2蛋白的表达,应用Transwell实验观察各组SW480细胞侵袭转移能力的改变。结果SW480表达PGE2的三种EP受体，EP1，EP2和EP4，PGE2可促进EP1的表达;经PGE2作用后，10分钟内PYK2磷酸化水平逐渐增加，0分钟、5分钟、10分钟检测结果相比差异均有统计学意义(P<0.05)，30分钟与0分钟检测结果相比差异无统计学意义(P>0.05);C组、D组与B组相比PYK2磷酸化水平明显下降(P<0.05)，大肠癌细胞侵袭转移能力显著降低(P<0.05)。结论 PGE2可能通过Ca2+，EP1促进PYK2的磷酸化，从而进一步诱导大肠癌细胞的侵袭转移过程。 【关键词】 大肠癌; PGE2; PYK2; EP1; 侵袭； 转移 Role of PYK2 in Invasion and Migration of Human Colorectal Cancer Cells Induced by PGE2 LAN Xiaoqin,WANG Ying,LI Meining,ZHANG Yuehong,XIE Jun,CHENG Niuliang Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China Corresponding Author: Cheng Niuliang， Email:chengniuliangty@yahoo.comAbstract：Objective To study the role of prolinerich tyrosine kinase 2(PYK2) in the invasion and migration of Human Colorectal Cancer SW480 Cells induced by PGE2. Methods The cells were divided into A、B、C and D group,including control group,PGE2 group, PGE2+SC19220(the antagonist of EP1)group and PGE2+BAPTAAM(Ca2+ chelator)group.The mRNA levels of the four types of EP receptors(EP1,EP2,EP3,EP4) of PGE2 in SW480 were analyzed by RTPCR. Western blotting was used to detect the protein level of PYK2,the invasive and migrative ability of SW480 cells was examined by transwell assay. Results EP1,EP2 and EP4 expressed in SW480 cells, and the mRNA level of EP1 elevated after being treated with PGE2. The phosphorylation level of PYK2 increased gradually within ten minutes after the treatment of PGE2, and the statistically significant differences were observed among the PYK2 phosphorylation at different time points including 0 min,5 min and 10 min (P<0.05), and there was no difference between the level at 30 and 0 min(P>0.05); the PYK2 phosphorylation of C group and D group degraded,compared with that of B group (P<0.05), the ability of invasion and migration of SW480 cells degraded accordingly(P<0.05). Conclusion PGE2 may promote the phosphorylation of PYK2 via Ca2+ and EP1,then induce the invasion and migration of human colorectal cancer cells. Key words：Colorectal cancer; PGE2; PYK2; EP1; Invasion; Migration 蛋白酪氨酸激酶是一类能催化ATP上的磷酸基转移到酪氨酸残基上，使其发生磷酸化的蛋白质，在细胞信号转导中占据重要地位。资料显示，超过50％的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常表达与活化导致细胞增殖调节发生紊乱,进而影响肿瘤的发生发展。富含脯氨酸的酪氨酸激酶 2(prolinerich tyrosine kinase 2，PYK2)，也称为Ca2+依赖性酪氨酸激酶，是粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)家族的成员之一。研究表明,它与很多肿瘤如前列腺癌[1]、肝癌[2]、乳腺癌[3]、结肠癌[4]等的发生发展密切相关。PGE2在诱导大肠癌细胞增殖侵袭转移中发挥重要作用，对其具体作用机制的探讨引起了很多学者的关注。PYK2是否参与了PGE2诱导大肠癌细胞恶性变的信号通路，目前不是很清楚。本研究以大肠癌细胞SW480为观察对象，研究PYK2在PGE2诱导大肠癌细胞迁移侵袭信号通路中的作用。1 材料和方法 1.1 主要试剂 大肠癌细胞株SW480购自上海细胞库； RPMI1640培养基购自Gibco公司；antiPYK2多克隆抗体，antiphosphoPYK2(Try881)多克隆抗体，HRP标记的二抗购自Santa Cruz公司；SC19220购自Cayman公司；BAPTAAM购自Alexis公司；硝酸纤维素膜购自Millipore公司；ECL发光试剂购自Amersham公司；复合磷酸酶抑制剂购自普利莱基因技术有限公司；反转录PCR试剂盒购自TaKaRa公司；transwell购自Costa公司；ECM gel购自Sigma公司；其他均为国产分析纯试剂。 1.2 实验分组 实验分四组,分别为A组： 未处理组、 PGE2组、 PGE2+SC19220组、 PGE2+BAPTAAM组。 B组： PGE2组， 即将PGE2加入到无血清培养48h后的SW480中。 C组、 D组分别为将无血清培养48h的细胞分别用SC19220（PGE2+SC19220组）、BAPTAAM处理1h后加入PGE2（PGE2+BAPTAAM组）。其中PGE2终浓度为1μmol/L， SC19220终浓度为10μmol/L， BAPTAAM终浓度为10μmol/L。 1.3 细胞培养 SW480细胞用含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的RPMI1640培养基于37℃、5% CO2培养箱内培养。 1.4 RTPCR检测 取A组和加入PGE2 6h的B组细胞（约1×106个），用TRIZOL试剂提取总RNA。反转录体系为 2μl MgCl2，1μl 10×RT buffer，2.25μl RNase free H2O，1μl dNTP，0.25μl RNA酶抑制剂，0.5 μl AMV，0.5 μl Oligo dT, 2μl RNA。反转录条件为30℃，10 min；42℃，1h；99℃，5 min；5℃，5min。PCR反应体系为5μl 5×PCR buffer，14.375μl灭菌蒸馏水，0.125μl Taq酶，上下游引物各0.25μl，PCR反应条件为95℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 30s；循环30次；72℃ 10min；4℃ 5min。引物序列如下:EP1(124bp)：5′cgctgcccatcttctccat 3′(上游)，5′gccacgaacagcaggaagg 3′(下游)；EP2(500bp)：5′ctgctccttgcctttcac 3′(上游)，5′cagccgattgttcctcc 3′(下游)；EP3(112bp)5′ CACCCGCCTCAACCACT 3′ (上游)，5′GGACACCGATCCGCAAT 3′(下游)； EP4(446bp)：5′aaggtgaaagcaggttgg 3′(上游)，5′ggacaggctgaagaagag 3′(下游)。Kodak成像系统成像，扫描各条带灰度值，以其与相应管家基因GAPDH的比值代表其相对含量。 1.5 Western blot检测 分别收集各组细胞，用PBS洗涤，并加入细胞裂解液（含复合蛋白磷酸化酶抑制剂）于冰上裂解30min，4℃ 12 000g离心10min,收集上清。用Bradford法测定蛋白浓度。取50μg样品进行SDSPAGE电泳分离蛋白，半干式电转移至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉封闭3h，分别加入用封闭液1∶500稀释的antiphosphoPYK2，antiPYK2多克隆抗体，4℃过夜，TBST洗3次，每次10min，加入HRP标记的二抗，4℃ 1.5h，TBST洗3次，每次10min，ECL发光，X线胶片曝光，显影，定影。应用Biorad凝胶成像仪将X线胶片上的Western blotting阳性条带进行灰度扫描，以其积分吸光度反应其信号的强度。以PPYK2与PYK2的吸光度值的比值反应PPYK2的相对水平。 1.6 Transwell迁移实验 分别收集各组细胞，用无血清培养基洗涤3次，计数，配成细胞悬液。每孔上室加入含（3～4）×104个细胞的细胞悬液100μl, 下室中加入1ml含20%胎牛血清的1640培养基。每组设 3个复孔，37℃培养箱中，孵育24h。取出Transwell小室，用PBS洗2次，4℃甲醇固定10min，0.1%结晶紫染色0.5h，用PBS洗2次，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察，计算穿过膜细胞的平均值。 1.7 Transwell侵袭实验 将ECM gel与无血清培养基以1∶1混合，按80μl/孔加入到Transwell上室，余步骤同迁移实验。 1.8 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件,多组比较采用方差分析，组间两两比较选用SNK法，P<0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1 PGE2促进SW480细胞EP1的表达 SW480细胞中，EP1、EP2、EP4都有表达，EP3表达缺失。加入PGE2后，EP1表达增加(P<0.05)，其他受体的表达均无显著变化，见图1。 2.2 PGE2促进PYK2磷酸化 大肠癌SW480细胞中,可检测到较弱的磷酸化PYK2的表达，经PGE2作用后，10min内PYK2磷酸化水平随时间逐渐增加，30min检测基本降至基础水平，见图2。半定量分析各时间点磷酸化PYK2相对水平,0、5、10min的PYK2磷酸化水平的之间差异有统计学意义(P<0.05)，30min与0min的检测结果之间差异无统计学意义(P>0.05)。 2.3 EP1和Ca2+介导了PYK2的磷酸化 加入PGE2 10min，PYK2磷酸化水平明显增加，EP1抑制剂SC19220和胞内Ca2+螯合剂BAPTAAM可明显降低PYK2的磷酸化，见图3a。半定量分析各组磷酸化PYK2相对水平，见图3b。经统计学分析,C、D组与B组相比,PYK2磷酸化水平明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。 2.4 EP1和Ca2+在PGE2诱导大肠癌细胞侵袭转移中发挥重要作用 Transwell实验结果显示B组与A组相比， 侵袭迁移能力增强， C、 D组与B组相比， 侵袭迁移能力显著下降，见图4、5。 经统计学分析， B与A之间， C、 D组与B组之间差异均有统计学意义(P<0.05)。提示PGE2可明显增加SW480细胞的侵袭转移能力, EP1和Ca2+在 PGE2诱导大肠癌细胞侵袭转移的过程中可能发挥重要作用。3 讨论 PYK2 基因是一种编码蛋白质酪氨酸激酶的基因，C端有两个富含脯氨酸的结构，各种能使细胞内钙离子浓度升高的细胞外刺激信号均能激活PYK2，其他如TNFα、紫外线照射，渗透压增高也能激活PYK2。常见的与PYK2相互作用的蛋白有Hic5、paxillin、P130Cas和src等[56]。PYK2与src的相互作用，参与了很多细胞信号转导通路[7]。接受细胞外信号刺激后，PYK2首先发生自磷酸化，磷酸化的Try402是SH2结构域的结合位点, 可募集另一种胞质酪氨酸蛋白激酶src的SH2结构域并与之结合，使src被磷酸化激活，活化的src反过来磷酸化PYK2的其他的酪氨酸磷酸化位点，使PYK2进一步激活, 产生多个与信号分子结合的位点，从而激活下游通路。Keely等[4]发现在人结肠癌T84细胞中，PYK2/src复合体可以激活下游的EGFR进一步促进结肠癌的增殖侵袭。 PGE2的受体有EP1、EP2、EP3、EP4四种；这些 Fig 2 Effect of PGE2 on the Pyk2 phosphorylation受体属于G蛋白耦连受体。实验中我们发现PGE2可以促进SW480细胞EP1的表达，这与Tang等[8]在成骨细胞中的研究相一致。PGE2与EP1结合后通过PLC引起细胞内Ca2+浓度增加[9]。因此，钙离子浓度升高可能是PGE2和PYK2的连接点，PGE2与受体结合引起钙离子浓度升高，而钙离子浓度升高又成为PYK2活化的刺激信号。在本实验中,我们通过测定PGE2作用后不同时点PYK2磷酸化水平，结果显示PGE2可促进PYK2的磷酸化。进一步实验我们发现EP1抑制剂和胞内Ca2+螯合剂可减弱PGE2的这种作用，表明EP1和Ca2+在PGE2促进PYK2磷酸化过程中可能发挥作用。 研究发现，PGE2通过csrc介导激活EGFR,进而通过PI3K/AKT途径促进大肠癌细胞的增殖，侵袭，转移[10]。但PGE2如何激活Csrc机制尚不清楚。因PGE2通过与受体EP1结合引起钙离子浓度升高并激活PYK2，而PYK2与src之间可以相互磷酸化形成复合体激活下游的EGFR。因此，我们推测：PGE2→EP1→Ca2+浓度增加→PYK2磷酸化→src磷酸化→EGFR→PI3K/AKT→大肠癌细胞增殖、侵袭、转移能力增强。 Transwell迁移侵袭实验是目前测定肿瘤细胞迁移侵袭能力最理想的模型。结果表明：C组与B组相比，大肠癌细胞侵袭迁移能力明显减弱,说明EP1在PGE2诱导大肠癌细胞恶性变中发挥重要作用,这与Han等[11]在胆管癌中的研究相一致。同时实验结果提示Ca2+,作为PYK2活化的必须信号，对SW480细胞的侵袭转移能力也有很大影响。 随着恶性肿瘤细胞信号转导的逐步阐明,与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶作为药物筛选靶点成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。对PYK2介导的PGE2诱导大肠癌细胞迁移侵袭信号通路的研究，有望为肿瘤的治疗提供新的靶点和依据。【参考文献】［1］ Sahu SN,Nunez S,Bai G,et al.Interaction of Pyk2 and PTPPEST with leupaxin in prostate cancer cells[J]. 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