下调Ezrin表达对前列腺癌细胞增殖和运动能力的影响

作者：谢柏臻，陈安民，郭风劲，宋登新，朱 波，祁 军，陈 超    作者单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科 　　【摘要】  目的 研究Ezrin蛋白对前列腺癌细胞增殖和运动能力的影响。方法 采用前列腺癌PC3细胞系作为研究对象，针对Ezrin蛋白的编码序列设计小干扰RNA片段，重组为shRNA表达载体转染入细胞，筛选出稳定表达的细胞克隆，RTPCR和Western blot分别检测Ezrin在基因和蛋白水平表达的变化，用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测增殖能力，流式细胞术检测细胞周期，Transwell法检测侵袭能力的变化。结果 PCR和Western blot显示shRNA对Ezrin在基因和蛋白水平均有显著的下调作用，转染后的前列腺癌细胞生长速度明显减慢，细胞周期显示处于分裂期的细胞比例由(24.58±4.23)%下降到(18.65±2.21)%，处于G1期的细胞数量则由(58.69±3.48)%上升到(66.54±4.13)%。穿过人工基底膜的细胞数量也由(38.6±5.4)减少为(24.5±2.7)（P<0.01）。结论 Ezrin对于前列腺癌细胞的增殖和运动能力有重要影响，可能成为肿瘤治疗的重要靶点。 　　【关键词】  Ezrin； shRNA； 前列腺癌　　Influence of Downregulate of Ezrin Expression by RNAi on  Proliferation and Invasion of  Prostatic Carcinoma　　XIE Bozhen, CHEN Anmin, GUO Fengjing, SONG Dengxin, ZHU Bo, QI Jun, CHEN Chao　　Department of  Orthopedics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan  430030, China  Corresponding Author: CHEN Anmin, Email：amchen@tjh.tjmu.edu.cnAbstract：Objective   To investigate the effect of Ezrin on the proliferation and invasion of human prostatic carcinoma. Methods  Human prostatic carcinoma cell line PC3 was cultured. A plasmid of a short hairpin RNA targeting Ezrin was constructed, and it was transfected into PC3 cell line. The expression of Ezrin mRNA and protein were examined by RTPCR and Western  blot method respectively. The proliferation was examined by MTT. Flow cytometry was used to detect the changes of cell cycle. Transwell test was used to detect the invasion ability of PC3. Results  RTPCR revealed that Ezrin shRNA notably downregulated expression at mRNA level (P<0.01). Western  blot also revealed notably downregulated expression at protein level (P<0.01). The proliferation was inhibited after RNAi treatment. The cell proportion in G2M phase decreased from  (24.58±4.23)%  to  (18.65±2.21)%.  The cell proportion in G1 phase increased from  (58.69±3.48)%  to  (66.54±4.13)%.The invasion ability decreased from (38.6±5.6) to  (24.5±2.7)(P<0.01). Conclusion  Ezrin is necessary for human prostatic carcinoma cell proliferation and invasion. It is probably an important factor to inhibit tumor.　　Key words：Ezrin;  shRNA;   Carcinoma of   prostate　　前列腺癌具有很高的骨转移倾向，大约70%的患者死于骨转移。关于前列腺癌易于发生骨转移的机制目前并未完全明确。Ezrin属于ERM（Ezrin/Radixin/Moesin）蛋白家族，是一种细胞膜细胞骨架联接蛋白，既能参与细胞的生长，又可在细胞外信号的调控下使骨架蛋白重排，增加细胞运动能力，导致肿瘤转移[1]。本研究以膜细胞骨架蛋白Ezrin为研究对象，通过RNAi技术下调前列腺癌PC3细胞系Ezrin的表达水平，检测干扰后细胞生物学行为的改变，探讨Ezrin蛋白对前列腺癌细胞生长和运动能力的影响，为前列腺癌的骨转移机制提供理论依据。　　1  材料和方法　　1.1  细胞系　　人前列腺癌PC3细胞系，由本室廖晖博士提供。细胞培养条件：37℃、5%  CO2、RPMI 1640培养基(Hyclone)+10%胎牛血清(Bioind)+500μg/ml G418。　　1.2  小干扰RNA表达载体的设计和构建　　在GeneBank里检索人Ezrin全长基因编码序列，采用Dharmacon网站小干扰RNA序列在线设计工具，以5′ATGCTATGTTGGAATACCT3′为干扰靶点。体外合成两端带BamH Ⅰ和Hind  Ⅲ粘性末端酶切位点，内含5′ATGCTATGTTGGAATACCTTTCAAGAGAAGGTATTCCAACATAGCAT3′发夹样序列的双链DNA，将合成的片段接入pSilence2.1neo载体，转化大肠杆菌DH5α，筛选、扩增、测序证实构建成功。同时，以5′GACTTCATAAGGCGCATGC3′为阴性对照序列，同样体外合成两端带BamH  Ⅰ和Hind Ⅲ粘性末端酶切位点，内含5′GACUUCAUAAGGCGCAUGCTTCAAGAGAGCATGCGCCTTATGAATTC3′发夹样序列的双链DNA，将合成的片段接入pSilence2.1neo载体，转化大肠杆菌DH5α，筛选、扩增、测序鉴定构建成功。转染试剂采用Lipofectamine2000TM（美国Invitrogen公司），依据说明书进行操作。分四组进行细胞转染：空白组、脂质体组、实验组、阴性对照组。G418筛选浓度为800μg/ml，以500μg/ml浓度维持筛选培养。　　1.3  细胞总RNA的提取和RTPCR　　使用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取细胞总RNA，并进行逆转录反应。PCR引物为Ezrin：5′CCCTCCAGTTCAAGTTCC3′（上游），5′AAGCCAAAGGTCTGTTCC3′（下游），扩增产物431bp，内参GAPDH：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′（上游），5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′（下游），扩增产物226bp。PCR条件：95℃  5min，94℃  50s，59℃  50s，72℃  1min，（循环32次）。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。RTPCR共进行4次，每次设5个平行孔，取平均值计算。　　1.4  Western  blot分析　　提取细胞总蛋白，经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，10%脱脂奶粉封闭1h，一抗为1∶1 000稀释的Ezrin（美国CST公司）和βactin（美国CST公司）。二抗为辣根过氧化物酶标记的IgG，1∶1 000稀释。PVDF膜依次与抗体作用后与免疫印迹化学发光试剂（ECL）反应。X线曝光，显影，定影后分析。重复4次，每次设5个平行样本，取平均值。　　1.5  四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测细胞增殖　　将转染后细胞接种于96孔板，接种密度为0.5×104/孔，每天进行MTT反应，测定540nm吸光度值，连续测定10天。绘制曲线比较转染后细胞与转染前生长速度的变化。重复4次，每孔设5个平行孔，计算吸光度的平均值。　　1.6  流式细胞仪检测细胞周期和凋亡    收集转染后扩增的细胞和非转染细胞各1×106个，70%冰乙醇固定，碘化丙啶（PI）染色，测定细胞周期和凋亡情况。重复4次,每个样品设5个平行管，取平均值计算。　　1.7  Transwell实验检测细胞侵袭力    孔径为8μm的24孔Borden小室（美国BD公司）。加1∶3稀释的Matrigel胶（美国Sigma公司）制作基底膜，上室加入1×105个细胞，总体积200μl，下室加入300μl含血清培养基，37℃培养24h后进行观察，计数基底膜下室的细胞数，于200倍显微镜下随机选择6个视野计数，取平均值为穿过基底膜的细胞数。共进行4次，每次设5个平行样本。　　1.8  统计学方法　　实验数据用Microsoft Excel和SPSS进行分析处理，对于MTT和Transwell结果采用配对t检验。　　2  结果　　2.1  质粒的细胞转染  PC3细胞经转染后，携带shRNA的质粒后筛选生长状况良好，转染率大约为75%，扩增后在荧光显微镜下观察，可见细胞均携带绿色荧光，见图1。　　2.2  转染后目标基因和蛋白的表达  RTPCR和Western  blot显示shRNA对Ezrin基因和蛋白水平的下调作用比较明显，见图2。RTPCR结果表明，阴性对照组的Ezrin基因表达灰度值为（2 409.156±54.315），干扰组的Ezrin基因表达灰度值为（195.517±12.369）（P<0.01），与GAPDH相比，沉默效率大约在90%以上。Westernblot结果表明，阴性对照组的Ezrin蛋白表达水平为（96.21±10.26）,干扰组的Ezrin蛋白表达水平为（19.59±1.12）（P<0.01）。　　2.3  MTT法测定PC3细胞干扰前后增殖情况的变化　　根据连续10天测定的实验组和阴性对照组细胞吸光度值，绘制细胞生长曲线，并对数值进行统计学分析，发现下调Ezrin蛋白，可以明显的减慢PC3细胞的增殖。初始值为（0.082±0.003），实验组细胞在第五天为（0.160±0.011），而阴性对照组则升　　2.4  流式细胞仪检测细胞周期与凋亡　　结果显示，干扰后的肿瘤细胞的细胞周期受到到明显的影响，证明EzrinshRNA转染后可明显抑制PC3细胞的增殖。处于分裂期的细胞比例平均由（24.58±4.23）%下降到(18.65±2.21)%，而G1期细胞比例则平均由(58.69±3.48)%上升到(66.54±4.13)%，见图4。　　2.5  Transwell检测细胞侵袭力　　通过计数实验组与对照组细胞穿过人工基底膜的细胞数量并进行比较，可以发现下调Ezrin蛋白后，肿瘤细胞的运动侵袭能力有明显下降，穿过人工基底膜的细胞数量明显减少，由（38.6±5.4）减少为（24.5±2.7）（P<0.01），见图5。　　3  讨论　　细胞骨架是指真核细胞质中的蛋白质纤维网架体系。它对于细胞的形状、细胞的运动、细胞内物质的运输、染色体的分离和细胞分裂等起着重要的作用。细胞骨架的改变在许多恶性肿瘤细胞中普遍存在，它可导致细胞运动能力的改变，而肿瘤细胞的运动能力增强是肿瘤发生远处转移的重要前提。Ezrin属于ERM蛋白质家族，几乎存在于所有细胞，在生理状态下，Ezrin能维持细胞极性、参与细胞运动、细胞间及细胞与ECM黏附，调节免疫细胞功能，并与细胞衰老死亡有关[2]。目前已经确定在肺癌、乳腺癌[3]、食管癌[4]、胃癌细胞中都有Ezrin表达的明显增高，并且认识到Ezrin的表达增高与肿瘤发生转移有密切的关系。　　本次研究采用RNA干扰的方法使Ezrin的表达下调。RNA干扰是近年来使用较多的一种用于基因研究的方法，具有特异性高和高效性等优点[5]。采用携带shRNA的质粒表达载体，能对目的基因产生持续的下调作用。本次研究中发现对Ezrin基因的下调大约在90%，对蛋白水平的下调率约为80%，证明shRNA表达载体是持续下调Ezrin的有效手段。经过RNA干扰后的细胞，增殖速度有明显的减低，细胞穿过人工基底膜的能力也明显的下降。这些表明下调Ezrin能明显的抑制肿瘤细胞的生长和侵袭能力。这个结果和Yu[6]在小儿横纹肌肉瘤中的研究结果一致。他们在低表达Ezrin的RMS细胞系中转染Ezrin后，能显著刺激裸鼠发生肺转移。Khanna等[7]在以豚鼠为模型的骨肉瘤研究中，发现Ezrin表达高的K7M2骨肉瘤细胞系比Ezrin表达低的K12细胞系具有更强的侵袭性和转移成瘤能力。　　随着对肿瘤细胞生长规律的了解，在以手术为中心，结合放疗、化疗、生物治疗等综合性的肿瘤治疗手段配合下，恶性肿瘤的5年生存率和生活质量都有了明显地提高，但是复发和转移依然是阻挠治疗效果进一步提高的主要障碍。大量的基础研究阐明了前列腺癌复发和转移的相关因素。Ezrin作为直接参与细胞运动的关键性分子，在肿瘤的增殖和侵袭中扮演了重要角色。本次研究表明，下调Ezrin可以明显地抑制肿瘤的增殖和侵袭，Ezrin蛋白有可能成为临床治疗肿瘤的重要靶点。在体外实验的基础上，体内进行肿瘤抑制的实验有了良好的理论依据。　　【参考文献】　　[1] Hunter KW. Ezrin, a key component in tumor metastasis[J]. Trends Mol Med， 2004，10(5):201204.　　[2] LouvetVallee S. ERM proteins: From cellular architecture to cell signaling[J]. Biol Cell, 2000, 92(5): 305316.　　[3] Li Q, Wu M F, Song A P, et al. Expression of ezrin and Ecadherin in invasive ductal breast cancer and their correlations to lymphatic metastasis[J]. Ai Zheng, 2006,25(3): 363366. 　　[4] Shen ZY, Xu LY, Chen MH, et al. Up regulated expression of ezrin and invasive phenotype in malignantly transformed esophageal epithelial cells[J]. World J Gastroenterol, 2003,9(6):11821186.　　[5] Hannon G J. RNA interference[J]. Nature, 2002, 418(6894): 244251.　　[6] Yu Y, Khan J, Khanna C, et al. Expression profiling identifies the cytoskeletal organizer ezrin and the developmental homeoprotein Six1 as key metastatic regulators[J].Nat Med, 2004,10(2):175181.　　[7] Khanna C, Nguyen P, Khan J, et al. Metastasisassociated differences in gene expression in a murine model of osteosarcoma[J]. Cancer Research, 2001 61(9): 37503759.