腹腔镜CO2气腹促进肿瘤生长与种植转移机制的研究进展

作者：周云生，解 雯综述 张树友审校    作者单位：南华大学附属南华医院普外科，湖南 衡阳 421002) 【关键词】  腹腔镜检查;气腹;肿瘤生长;肿瘤种植;肿瘤转移;综述文献

　　腹腔镜手术创伤小、恢复快、对机体免疫系统抑制小,自法国Mouret完成第1例腹腔镜胆囊切除术以来,以腹腔镜为代表的微创外科手术在普外、妇产、泌尿、胸外和整形等各个外科领域得到广泛应用,微创外科正以前所未有的速度发展,其在恶性肿瘤根治中的应用,特别是腹腔镜结、直肠癌根治术的开展近年来也已较为普遍,已被公认为是21世纪外科发展的主流方向之一。随着腹腔镜技术的不断完善,手术操作的安全可行性均已得到证实[1];而腹腔镜手术在肿瘤根治原则方面,也已与开腹手术没有差异[2，3]。在这样一种前提下,CO2气腹作为腹腔镜手术中有别于开腹手术的一种常用手段,其在肿瘤细胞转移中的作用,成为研究者们更为关注的焦点。随着腹腔镜手术的应用范围日益扩大,其在肿瘤诊治方面也出现了一些新的问题,如术后戳口肿瘤细胞的局部种植与转移及腹内的广泛扩散,一些关注腹腔镜技术中不同气腹介质的作用及不同建立方法(如非气腹腹腔镜)与恶性肿瘤关系的研究报告也相继出现。通过临床与实验观察初步发现, 在腹内恶性肿瘤诊治手段方面,开腹手术比腹腔镜手术在术后更易导致肿瘤的扩散[4],而在腹腔镜手术方面用二氧化碳(CO2)作为气腹介质比用空气和氦气(He) 更易导致肿瘤的扩散[5],而非气腹腹腔镜手术对肿瘤患者的影响最小[6]。然而由于腹腔镜手术后肿瘤细胞切口种植的报道,一些外科学者对腹腔镜手术治疗恶性肿瘤尚采取谨慎态度,其安全性仍存在争议[7]。因为非气腹腹腔镜建立需要相当的设备,在周边视野暴露等方面并不及气腹腹腔镜,虽有独特优势,但不可能取而代之。虽然目前提倡使用氦气,但毕竟价格昂贵,来源有限,况且有报道指出氦气的使用使得患者术中和术后气体栓塞的发生率大大上升。当前国内外普遍仍以CO2建立气腹。CO2气腹促进肿瘤生长与种植转移的现象,目前尚无令人信服的解释。国内王灏[8]等通过胃癌细胞株SGC7901于SD大鼠腹腔注射后建立CO2气腹, 并收集不同流速、不同气腹压及不同持续时间后的大鼠腹腔冲洗液作肿瘤细胞培养,每组随机取2只做对照组,结果显示大流量(5 Lmin)、高腹压(30 mmHg)、长时间(60 min) 易致手术切口种植转移, 其机制主要涉及物理因素, 如频繁更换器械致肿瘤细胞沾染,CO2气雾作用使肿瘤细胞漂浮,肿瘤组织取出时与正常组织的接触,高气压下的腹膜更易遭受肿瘤细胞种植等[9]。但这些推论并不能解释用其他气体形成气腹状态时肿瘤细胞并无明显扩散的现象。目前其他的可能原因如下。

　　1 局部与全身免疫的影响

　　关于CO2气腹促肿瘤生长与转移的一种可能机制是免疫方面。有研究比较了CO2气腹与空气气腹免疫指标变化,在腹腔镜结肠切除后,血肿瘤坏死因子A(TNFA)、白细胞介素6(IL6)、白细胞介素1B(IL1B) 等CO2组较空气组下降显著,提示CO2有免疫下调作用。Neuhaus等[10]将18只同基因同免疫能力的小鼠随机分成3组,并腹腔灌注相同的腺癌细胞建立CO2气腹,18 h后3组分别经腹腔镜给予环孢菌素(免疫抑制剂)、内毒素(免疫增强剂)、空白对照。7 d后处死全部小鼠观察,发现环孢菌素组较其他两组明显发生肿瘤种植转移,作者认为免疫下调与肿瘤细胞种植关系密切。Jacob等[11]通过荷瘤(DHDK12T Rb)小鼠建立不同气体腹腔镜观察肿瘤生长情况,发现CO2气腹组除比He气组及对照组能促进肿瘤生长外,显著的血TNF2A下降与白细胞介素10(IL10)升高亦使CO2气腹组有别于另两组,并认为与其促进机制有关。West等[12]通过体外不同气体培养下腹腔巨噬细胞分泌TNFA、白细胞介素1(IL1)及细胞内pH值变化研究,小鼠体内腹膜组织pH值变化及巨噬细胞分泌TNFA的检测,认为不论体内外CO2的暴露均可显著减弱LPS(脂多糖)介导的细胞因子释放。在体外,CO2培养下巨噬细胞分泌TNFA、ILl显著减弱,细胞内pH值显著下降,并认为巨噬细胞胞质酸化pH值降低明显抑制其功能,特别是TNFA有显著抗肿瘤作用,局部免疫功能下降将导致肿瘤细胞的黏附增殖。在体内,变化类似。Neuhaus等[13]亦持有类似观点,并推测CO2致使免疫下调首要原因是腹膜巨噬细胞功能抑制,对肿瘤细胞的杀伤力大为减弱。

　　2 局部微环境化学因素的影响

　　Volz等[14]通过穿刺探针对裸鼠不同气腹腹膜表面pH值变化与腹膜间皮细胞结构改变研究,发现CO2可对腹膜微环境产生严重干扰如酸中毒等,并认为降低腹压与更换其他气体可消除这些不利影响。在另一组实验中,Volz等通过建立裸鼠腹腔内间皮瘤模型,并分别注入He、CO2、加热CO2以检测动物存活率,结果CO2气腹组存活率明显减低。Volz等[15]在分析腹膜的超微结构后,指出CO2对腹膜间皮细胞的机械高压与化学损伤(酸中毒) 致基底膜暴露,底层结缔组织剥脱, 表面负电荷变性等使瘤细胞易于黏附生长与种植转移。Volz等[16]还通过对C257 黑鼠行CO2气腹后1，2，6，12，24，48，72，96 h肿瘤细胞在腹膜表面生长的形态学电镜观察与分析,建立了CO2气腹促肿瘤生长与种植的病理依据,强调腹膜完整性的破坏是重要原因之一。Kuntz等[17]则比较了大鼠不同气体(空气、笑气、He、CO2)、不同压力腹腔镜皮下、腹腔内、血液pH 值变化,结果认为CO2对皮下、腹腔内pH影响较大,其他气体则影响甚微,并认为低pH是CO2促肿瘤生长与种植的原因之一。Yamaguchi等[18]将注射5A2106人胃癌细胞的BALBc小鼠按是否使用CO2气腹与透明质酸分为4组。结果使用CO2气腹并使用透明质酸组明显发生戳口肿瘤细胞的局部种植与腹腔内扩散,而CO2气腹组在使用与不使用透明质酸之间差异有显著性,认为分泌透明质酸的腹膜间皮细胞参与了CO2促进肿瘤生长与种植转移。而Jacobi等[17]在一组体外试管内试验中证实了充入的CO2改变了癌细胞的内外H+ 浓度,pH值从7.5降到6.6,将需氧代谢转变为厌氧代谢从而处于酸中毒状态,有利于激活与细胞有丝分裂相关酶,促肿瘤生长。此外,瘤细胞内辅酶 比值下降,保护其不受氧自由基损害。

　　3 气体的化学性质

　　气体通过腹膜吸收后, 水溶性很高的CO2与H2O反应形成H+和HCO3, 产生的H+可导致局部pH下降。Wildbrett等[19]采用CO2、He气体建立气腹, 观察细胞内外pH值的变化。结果显示, CO2气腹组细胞内外pH值均明显下降(pH 7.4～6.2), 在He气腹组, 建立气腹后pH上升。Wong等[20]以猪为实验动物, 观察CO2气腹下实验动物的腹膜及肠浆膜pH值的变化, 结果显示, 在15 mmHg(1 mmHg=0.133 332 kPa)的CO2气腹下3 h内,实验动物的腹膜和肠浆膜内均出现严重的酸中毒(pH 6.59～6.74),以加温和湿化的CO2气体建立气腹组动物也出现类似的代谢反应。通过静脉输入碳酸氢盐并不能纠正腹膜局部的pH下降。而开腹组动物腹膜和肠浆膜内pH无明显变化。

　　机体凝血功能与腹腔中游离肿瘤细胞的黏附与生存密切相关, 在pH值下降时, 凝血时间缩短, 肿瘤细胞粘附到切口部位后, 酸性环境下的纤维蛋白更易将其包裹, 使其免受宿主免疫细胞的攻击[19]。此外，细胞因子的分泌、炎症介质的释放等细胞的基本生命活动的正常进行有赖于内环境的稳定, 细胞内pH值必须维持在合理的水平才能保持细胞内酶的最佳活性, 吞噬细胞才能对肿瘤细胞发挥有效的攻击。在CO2气腹时, 细胞内pH水平降低, 宿主的免疫细胞功能受到明显损害[19]。

　　4 气腹的机械压力因素

　　Wittich等[21]评价不同压力空气和对肿瘤生长的影响,以500 000个结肠癌细胞注人实验动物腹腔后, 将实验鼠分为空气和He气腹组, 每一组又按建立的气腹压力不同分为免气腹组、4 mmHg、气腹1 h组、10 mmHg气腹1 h组和16 mmHg气腹1 h组，术后评价腹腔内肿瘤细胞的生长情况。结果显示, 在He气腹组与空气组中, 气腹压越高者, 肿瘤细胞生长越快。研究者认为, 在惰性气体He组中, 已排除了气体化学因素的作用, 说明气腹的压力是影响肿瘤细胞生长的重要因素之一。气腹导致的腹内压增加可破坏腹膜屏障的完整性，有电镜观察表明，气腹下腹膜内皮层细胞间连接变宽[22], 腹膜内皮层结构完整性的破坏有利于肿瘤细胞的吸附与种植。Ordemann等[23]观察实验鼠在CO2和He气腹下的腹膜形态的变化。给实验动物腹腔内注射结肠癌细胞后, 将其分为:15 mmHgCO2气腹,15 min组15 mmHgHe、气腹组15 min和免气腹对照组, 分别于术后2，12，24，48和96 h,处死实验动物, 采用电镜观察其腹膜变化。结果显示, 对照组实验动物腹膜无明显变化, 而气腹组有一部分动物在各时间点腹膜发生炎症改变, 内皮细胞肿胀回缩,肿瘤细胞吸附在腹膜表面, 在后期出现肿瘤细胞进一步浸润生长, 局部淋巴结肿大。

　5 腹壁血流量减少和局部防御功能减弱

　　腹壁正常的血液供应是局部组织细胞代谢能源的保障, 亦是发挥腹膜正常屏障功能的基础。腹内压增加时, 腹壁组织血供严重下降。Lundberg等[24]观察气腹对腹壁血流和已经种植的肿瘤生长活性的影响。将50 000个结肠腺癌细胞注人实验大鼠的腹直肌后, 实验动物分为：10 mmHg空气气腹45 min组和免气腹对照组, 采用激光多谱勒监测实验动物腹直肌血流量的变化。结果显示, 建立气腹后, 实验组腹壁血流减少82%(P<0.001)，对照组无明显的变化。术后9 d, 气腹组腹腔肿瘤重量和大小与对照组相比亦有显著性差异(P=0.003和P<0.001), 肿瘤淋巴结转移和对照组相比也有显著性差异(20/20和14/20,P=0.016)。研究者认为, 气腹可减少腹壁的血流量, 从而使腹壁对肿瘤细胞种植的易感性增加, 有利于肿瘤细胞的生长。

　　6 肿瘤细胞的生物活性变化

　　一些实验研究表明[2527]，CO2气腹后，肿瘤细胞增生活跃，一些与肿瘤细胞生长，转移有关的分子表达增加。Yokoyama等[25]以小鼠为模型，比较不同气体气腹对腹腔中肿瘤细胞的影响，实验动物随机分为CO2、He、空气组和对照组，建立10 mmHg气腹，维持30 min,术后第7天采用流式细胞仪检测腹腔S期肿瘤细胞数。结果显示,CO2气腹组S期肿瘤细胞比空气组、He组和对照组均更多。Cai等[26]发现结肠癌细胞的血管内皮生长因子表达均增加，而且CO2组增加更为明显。肿瘤形成以后，肿瘤细胞进一步侵袭周围组织和血管，形成转移性病灶，细胞外基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinases,MMP)在这一生物事件中起着重要的作用，MMP可以通过降解基底膜和细胞外组织，从而促进肿瘤血管的形成。有研究表明，CO2气腹可通过核因子kB通路上调MMP的表达，从而增加肿瘤细胞的侵袭力[28]。Paraskeva等[27]将人结肠腺癌细胞株置于CO2和He气体中培养4 h,观察MMP2、MMP9和血浆尿激酶原激活因子浓度的变化。结果显示，CO2气体处理后的结肠癌细胞MMP2,MMP9和血浆尿激酶原激活因子产生增加。Jacobi等[29]采用He、CO2空气培养肿瘤细胞，观察肿瘤细胞侵袭性的变化和MMP基因的表达，结果显示，与空气处理组相比，CO2、He组结肠癌细胞对人工基底膜的侵袭力明显增加，CO2气体组和空气组之间差异具有统计学意义。此外，亦有学者认为CO2气腹可以通过影响细胞的凋亡，进一步破坏肿瘤组织内新生细胞与凋亡细胞之间的数量平衡，促进肿瘤的生长。

　　7 CO2气腹对肿瘤黏附性能的影响

　　现已明确整合素、细胞间黏附分子1、CD44及其变异体CD44V6 等一些细胞黏附分子参与了细胞细胞、细胞基质之间的相互作用,在肿瘤种植转移中起着重要的作用[30]。一方面,经过CO2气腹作用,肿瘤细胞对机体组织黏附力增强。Kim等[31]体外实验研究发现,CO2气腹处理后,肿瘤细胞表面促进肿瘤转移相关的黏附分子ICAM1、CD44std (标准型)表达增强;而抑制肿瘤转移相关的黏附分子钙粘着蛋白表达却明显减少。Gutt等[32]随机将30只WAG/RIJ系大鼠分为CO2 气腹组、无气腹组、剖腹组,并均在90 min的手术过程中向门静脉注射等量结肠癌细胞, 28 d后用免疫组织化学和图像分析技术检测肝脏转移癌中CD44V5、CD44V6 的表达,表明CO2气腹组的表达明显高于无气腹组。另一方面,经过CO2气腹作用,机体组织对肿瘤细胞黏附力增强。Ziprin等[33]观察发现,CO2气腹下腹膜间皮细胞对肿瘤细胞黏附增强,而且伴有的ICAM1表达增加。Izumi等[34]随机将BALB /C系小鼠分成3组,在脾内注入结肠癌细胞后分别进行CO2气腹术、开腹术、单纯麻醉,术后采用RT2PCR法检测小鼠肝脏组织ICAM1mRNA表达,结果表明,CO2气腹组肝脏组织ICAM1mRNA表达高于其他组(P < 0.05) ,从而得出结论,CO2气腹能增强肝脏组织中ICAM1表达,促进肝脏对肿瘤细胞的黏附,导致肿瘤肝转移。因此, CO2气腹可能通过增强肿瘤细胞和腹膜、腹腔脏器之间相互黏附的性能促进肿瘤的种植转移。

　　8 其他因素

　　腹腔镜肿瘤手术过程中,不可避免会产生一定量的悬浮肿瘤细胞。人工CO2 气腹建立、稳定时由于压力梯度、气流吹入作用使CO2从戳孔处渗漏,在戳孔局部形成湍流,使肿瘤细胞漂浮迁移戳孔处,引起肿瘤细胞种植,即所谓的"烟囱效应"。大量冷CO2气体的吹入使腹腔内体温过低,也容易导致肿瘤腹腔种植转移。腹腔镜术后仔细完整的切除戳口处的腹膜、筋膜、皮肤层和穿刺点周围组织，可以明显降低穿刺部位的种植转移。

　　9 结语

　　综上所述,CO2气腹促进肿瘤生长与种植转移机制和局部与全身免疫，局部微环境化学因素的影响、气体的化学性质、气腹的机械压力、腹壁血流量减少和局部防御功能减弱、肿瘤细胞的生物活性变化、CO2气腹对肿瘤黏附性能的影响等因素有关，但是由于腹腔镜手术具有创伤少、恢复快、住院时间短等优势,腹腔镜技术用于早期恶性肿瘤手术已为大多数肿瘤外科医师认同。尽管没有多中心的前瞻性随机对照研究来客观评价腹腔镜下恶性肿瘤手术的优劣,但在世界各地,腹腔镜下恶性肿瘤手术的临床实践和研究仍在不断迅速发展。我们有理由相信,随着研究的深入,肿瘤种植转移的潜在风险会得到很好的控制,腹腔镜在肿瘤外科方面的应用将具有非常广阔的前景。

【参考文献】  1 Clinical Outcomes of Surgical Therapy Study Group. A comparison of laparoscop ically assisted and open colectomy for colon cancer[J]. N Engl Med, 2004, 350(20): 20502059.

　　2 Korolija D, Tadic S, Simic D. Extent of oncological resection in laparoscopic vs. open colorectal surgery: meta analysis. Langenbecks[J] . Arch Surg,2003,387(9210):366371.

　　3 Leung KL, Kwok SP, Lam SC, et al. Laparoscopic resection of rectosigmoid carcinoma: prospective randomised trial[J]. Lancet, 2004,363 (9416) :11871192 .

　　4 Bouvy ND,Marquet RL , Jeekel H, et al. Impact of gas(less) laparoscopy and laparotomy on peritoneal tumor growth and abdominal wallmetastases [J]. Ann Surg, 1996, 224(6):694700.

　　5 Gutt CN, Riemer V, Kim ZG, et al. Impact of laparo scopic colonic resect ion on tumour growth and spread in an experimental model [J]. Br J Surg, 1999,86(9):1180 1184.

　　6 Watson DI, M athew G, Ellis T, et al. Gasless laparoscopy may reduce the risk of port site metastases following laparascopic tumor surgery [J]. Arch Surg,1997,132(2):166168.

　　7 Alexander RJ, Jaques BC, Mitchell KG. Laparoscopically assisted CO2 lectomy and wound recurrence[J]. Lancet, 1993,341(8839):249250.

　　8 Wang Hao, MinHua Zheng, Haobo Zhang, et al. CO2 pneumoperitoneum on tumor cells laparoscopic people stamp the impact of plant population [J]. Surgery Theory and Practice,1999,4(3):141 143.

　　9 Kohlberger PD, Edwards L, Collins C, et al. Laparo scopic port site recurrence following surgery for a stage IB squamous cell carcinoma of the cervix w ith negative lymph nodes[J]. Gynecol Oncol, 2000, 79(2):324 326.

　　10 Neuhaus SJ , Watson D I, Ellis T, et al. The effect of immune enhancement and suppressionon on the development of laparo scopic port site metastases [J]. Surg Endosc, 2000,14(5):439 443.

　　11 Jacobi CA, Wenger F, Sabat R, et al. The impact of laparo scopy with carbon dioxide versus helium on immuno logic funct ion and tumor growth in a rat model[J]. Dig Surg, 1998,15(2):110116.

　　12 West MA, Hackam DJ, Baker J, et al. M echanism of decreased in vitro murinemacrophage cytok inere lease after exposure to carbon dioxide[J]. Ann Surg,1997,226(2):179 190.

　　13 Neuhaus SJ, Watson D I, Ellis T, et al. The effect of immune enhancement and supp ressionon on the development of laparo scopic port site metastases [J]. Surg Endo sc,2000,14(5):439443.

　　14 Volz J, Koster S, Spacek Z, et al. Characteristical terations of the peritoneum after carbon dioxide pneumoperitoneum[J]. Surg Endo sc,1999,13(6):611614.

　　15 Volz J , Koster S, Schaeff B, et al. The effects of insufflation gas on tumo r2induced lethality in nude m ice [J]. Am J O bstet Gyneco l,1998,178(4):793 795.

　　16 Volz J , Ko ster S, Spacek Z, et al. The influence of pneumoperitoneum used in laparo scopic surgery on an int raabdom inal tumo r growth[J]. Cancer, 1999,86 (5):770774.

　　17 Kuntz C, W unsch A, Bodeker C, et al. Effect of p res2 sure and gas type on int raabdom inal, subcutaneous,and blood pH in laparo scopy[J]. Surg Endo sc,2000,14(4):367371.

　　18 Yamaguch i K, H irabayash i Y, Sh irom izu A , et al. Enhancement of po rt site metastasis by hyaluronic acid under CO 2 pneumoperitoneum in a murinemodel [J]. Surg Endo sc, 2001,15(5):504507 .

　　19 Wildbrett P, Oh A, Naundorf D, et al. Impact of laparoscopic gases on peritoneal microenvironment and essential parameters of cell function[J].Surg Endosc ,2003,17(1):7882.

　　20 Wong YT, Shah PC, Birkett DH, et al. Carbon dioxide pneumoperitoneum causes severe peritoneal acidosis,unaltered by heating, humidification, or bicarbonate in a porcine mode [J].Surg Endosc,2004,18(10):14981503.

　　21 Wittich P, Mearadji A, Marquet RL, et al.Increased tumor growth after high pressure pneumperitoneum with hclium and air. J Laparoendose Adv[J]. Surg Tech A,2004,14(4):205208.

　　22 Neuhaus SJ, Watson DI. Pneumoperitoneum and peritoneal surface changes;a review[J]. Surg Endosc,2004,18(9):13161322.

　　23 Ordemann J, Jackob J, Braumann C, et al. Morphology of the rat peritoneum after carbon Dioxide and helium pneumoperitoneum;a scanning electron microscopic study[J].Surg Endosc,2004,18(9):13891393.

　　24 Lundberg O， Knstoffersson A. Pneumoperitoneum impairs blood flow and augments tumor growth in the abdominal wall[J]. Surg Endosc,2004,18(2):293296.

　　25Yokoyama M, Ishida H, Okita T, et al. Oncological effects of insuffiation with different gases and a gasless procedure in rats[J]. Surg Endosc, 2003,17:11511155.

　　26 Cai KL, Wang GB, xiong LJ. Effects of carbon dioxide and nitrogen on adhesive growth and expressions of Ecadherin and VEGF of human colon cancer cel CCL228[J].World J Gastroenterol,2003,9(7):15941597.

　　27 Paraskeva PA, Ridgway PF, Jones T, et al.Laparoscopic environmental changes during surgery enhance the invasive potential of tumours[J].Tumour Biol,2005,26(2):94102.

　　28 Are C, Talamini MA. Laparoecopy and malignancy. J Laparoendosc[J].Adv Sung Tach A,2005,15(1):3847.

　　29Jacobi CA, Bonjer HJ, Puttick MI, et al. Oncologic implications of laparoscopic and open surgery[J].Surg Endosc,2002,16(3):441445.

　　30 Chen Bing, Wenbin Huang. CD44V6 in colorectal carcinoma and its clinical significance[J]. World Chinese Journal of Digestology,2002,10(4):471472.

　　31 Kim ZG, Mehl C, LorenzM, et al. Impact of laparoscopic CO2 insufflation on tumor associated molecules in cultured colorectal cancer cells[J]. Surg Endosc, 2002,16(8):11821186.

　　32 Gutt CN, Kim ZG, Schemmer P, et al. Impact of laparoscop ic and conventional surgery on Kupffer cells, tumor2associated CD44 expression, and imtrahepottic tumor sp read[J].Arch Surg, 2002,137(12):140821412.