三羟异黄酮对孕期乳腺癌(MMTV)ErbB2转基因子代小鼠乳腺肿瘤的干预作用

作者：宋海云，陈登庭，侯建峰，介晓阳    作者单位：河南科技大学第一附属医院，河南洛阳 471003 【摘要】  目的 观察三羟异黄酮干预孕期乳腺癌(MMTV)ErbB2转基因小鼠对其子代小鼠乳腺肿瘤发生、发展的影响。方法 按三羟异黄酮20 μg、100 μg溶于2%二甲基亚砜（DMSO）和0.05 mL植物油中，对照组给予等量植物油处理，将孕鼠随机分为低、高剂量三羟异黄酮给药组和正常对照组，每组30只，自孕期第13～19天采用母鼠后腿外侧皮下注射，观察三羟异黄酮给药组子代雌性小鼠和对照组子代雌性小鼠乳腺肿瘤的潜伏期和乳腺成瘤率是否存在差异，并用免疫组织化学染色SP方法检测子代小鼠乳腺肿瘤组织p53的表达情况。结果 高剂量组乳腺肿瘤潜伏期、乳腺成瘤率与其他各组相比具有统计学差异（P＜0.05）；高剂量组p53的阳性表达水平明显低于其他各组（P＜0.05）。结论 孕期使用高剂量异黄酮可以延长子代雌性小鼠肿瘤发生的潜伏期，降低乳腺成瘤率，并且可以降低子代小鼠乳腺肿瘤中p53的阳性表达水平，提示三羟异黄酮对乳腺癌(MMTV)ErbB2转基因小鼠乳腺肿瘤的发生、发展具有一定的预防作用。

【关键词】  (MMTV)ErbB2转基因小鼠；乳腺癌；三羟异黄酮；p53

　　Effect of Genistein on Breast Cancer During Pregnancy (MMTV)ErbB2 Transgenic  Offspring Intervention of Mouse Mammary Tumor

　　SONG Haiyun, CHEN Dengting, HOU Jianfeng,et al

　　First Affiliated Hospital，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China

    Abstract:Objective  Observation of genistein interferes with breast cancer during pregnancy (MMTV)ErbB2 transgenic mice to their offspring mouse mammary tumor occurrence and development impact.  Methods  According to genistein 20μg, 100μg dissolved in 2% DMSO (dimethyl sulfoxide), and 0.05ml vegetable oil in the control group was given equal amount of vegetable oil processing. The pregnant rats were randomly divided into low and high dose of genistein treatment group and normal control group，n=30, since the pregnancy the first 13 to 19 days using female mouse hind leg lateral subcutaneous.Observation of genistein treatment group were offspring of female offspring of female mice and the control group mouse mammary tumor latency and the existence of mammary tumor formation rate differences，and SP immunohistochemical staining to detect breast tumors in mice offspring p53 expression.    Results  The incubation period of highdose group of breast cancer, breast tumor formation rate compared to other groups with significant difference (P<0.05); highdose group p53 positive expression was significantly lower than other groups (P<0.05).    Conclusion  The use of high doses of isoflavones during pregnancy can be extended offspring of female mice with tumor latency, reducing the rate of breast tumor formation, and may reduce the offspring of mice with breast tumor levels of positive expression of p53， suggesting that genistein on breast cancer (MMTV)ErbB2 transgenic mouse mammary tumor occurrence and development of a certain preventive effect.

    Key words:(MMTV)ErbB2 transgenic mice；breast cancer；genistein;p53

　　乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，在西欧、北美等发达国家，乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤首位，我国乳腺癌的发病率也正在逐年上升。国家与地区间发病率存在着悬殊差异，目前乳腺癌的发病原因还不清楚，资料表明只有10%～15%的乳腺癌病例与基因、年龄、家族生育史等影响因素有关[1]，饮食因素在乳腺癌病因中所起的作用逐渐引起广泛关注。临床上erbB2高表达的乳腺癌患者预后不良相关，近年来利用转基因技术构建的（MMTV）ErbB2转基因鼠得到应用。本研究以美国Jackson实验室引进的乳腺癌(MMTV)ErbB2转基因小鼠模型为研究对象，通过繁殖传代在母鼠孕期第13～19天注射不同剂量三羟异黄酮（genistein），观察孕期接触三羟异黄酮对erbB2转基因子代小鼠乳腺肿瘤的潜伏期、乳腺成瘤率、乳腺肿瘤组织病理类型以及p53表达情况的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  研究对象

　　由美国Jackson实验室引进的（MMTV)ErbB2转基因小鼠，是利用转基因技术构建，高表达促进乳腺癌细胞增殖的erbB2原癌基因，是研究erbB2高表达乳腺癌的良好动物模型。

　　1.2  主要试剂

　　三羟异黄酮，购自美国Sigma化学公司，纯度大于99%，2%DMSO溶剂购自北京中杉金桥公司，三羟异黄酮临用前溶于2%DMSO备用。鼠抗人p53免疫组化单克隆浓缩型抗体、SP试剂盒、DAB显色剂（均由北京中杉金桥公司提供）。

　　1.3  动物分组及给药

　　选择健康5～6周（MMTV)ErbB2转基因小鼠，2∶1雌雄合笼，以阴栓脱落当天定为妊娠第1 d，按三羟异黄酮20 μg、100 μg溶于2%DMSO和0.05 mL植物油中，对照组给予等量植物油处理，将孕鼠随机分为低、高剂量异黄酮给药组和正常对照组，自孕期第13～19天采用母鼠后腿外侧皮下注射，连续给药7 d，1次/d，停药至小鼠出生，弃去子代雄鼠，每组随机选择30只子代雌性小鼠，于出生后第21天子鼠断乳，每笼5只分养，喂饲不含任何豆类成分饲料后进行观察。

　　1.4  检测指标

　　1.4.1  乳腺肿瘤潜伏期、乳腺成瘤率以及乳腺肿瘤组织的形态学观察

　　从第20周起每周两次检查乳腺肿瘤的发生情况，一般肿瘤在直径3 mm时便可检出，记录为乳腺肿瘤发生时间，待肿瘤直径长至1.5 cm时，手术切除肿瘤，收集肿瘤样本10%中性福尔马林固定做病理切片，并经HE染色后作形态学观察及分析。

　　1.4.2  乳腺肿瘤组织石蜡切片p53的表达情况

　　采用免疫组化SP法检测p53的表达情况，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，用已知阳性免疫组化片作阳性对照(对照片由北京中杉金桥公司提供)。免疫组化结果评价采用半定量计分法，镜下观察肿瘤细胞核或细胞质出现棕黄（褐）色为阳性。

　　1.5  统计学方法

　　数据采用±s表示，采用SPSS11.5软件进行完全随机设计的方差分析比较各实验组的区别，乳腺成瘤率、p53的表达阳性率比较均用2检验和Fisher确切概率法，P＜0.05表示有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  各组发生肿瘤例数、肿瘤平均潜伏期情况比较　　　　高剂量组肿瘤平均潜伏期为47.1±5.2周，低剂量组、对照组相比有显著性差异（P<0.05）；乳腺成瘤率为27％，与低剂量组相比有显著性差异（P<0.05），与对照组相比有显著性差异（P<0.01）；低剂量组、对照组之间的肿瘤平均潜伏期比较无统计学差异（P＞0.05），乳腺成瘤率比较无统计学差异（P＞0.05）。见表1。表1  各组发生肿瘤例数、肿瘤平均潜伏期（±s）情况比较（略）

　　2.2  乳腺肿瘤组织的形态学观察

　　所有乳腺肿瘤组织经HE染色后镜下观察证实为乳腺癌，可见肿瘤细胞排列密集，细胞与间质界限清楚，细胞核大，深染，异型性明显。肿瘤细胞周围有炎性细胞浸润（见图1）。

　　2.3  各组乳腺肿瘤组织p53的表达情况

　　高剂量组p53阳性表达率为37.5％，与低剂量组相比具有统计学差异（P<0.05），与对照组相比具有统计学差异（P<0.05），而低剂量组与对照组p53阳性表达率比较无统计学差异（P＞0.05），见表2。表2  各组乳腺肿瘤组织p53的表达情况比较（略）

　　3  讨论

    erbB2是表皮生长因子受体（EGFR)家庭成员之一，属于Ⅰ类受体酪氨酸激酶(TPK)超家族，erbB2在20%～40%的乳腺癌中明显扩增及过表达，与乳腺癌预后不良相关，转基因技术构建的MMTVErbB2转基因鼠是目前研究乳腺癌发病机理的理想模型。A：HE染色，×400B：HE染色，×400       三羟异黄酮因其分子结构与动物雌激素结构相似，具有弱雌激素样的作用，能够模拟和干扰雌激素的生理生化作用，被称为植物性雌激素。然而随着研究的深入，发现三羟异黄酮作用机制复杂，在乳腺癌的动物试验中，三羟异黄酮与乳腺癌的关系存在众多争议，Hilakivi Clarke[2]报道子宫内接触三羟异黄酮的子鼠DMBA诱导的乳腺癌发病率较高，而Pei RJ[5]等发现孕期三羟异黄酮处理对对乳腺癌具有预防作用。三羟异黄酮是一类来源于植物、在结构和功能上与雌二醇相似的化合物[3]，既有不完全雌激素效应又有不完全雌激素拮抗作用的活性植物成分，它的双向调节作用对激素相关性疾病特别是乳腺癌、前列腺癌等疾病有广泛的作用，已有大量流行病学和实验研究证据表明其具有抗肿瘤作用，尤其是对乳腺癌防治可能具有重要意义。肿瘤的发生、发展与抑癌基因的失活或缺失有关，p53等抑癌基因的异常可以导致肿瘤的发生与发展[4]，有关p53表达与乳腺癌的关系国内外少见报道。孕期是子代生长发育的关键时期，在这个时期，乳腺大量处于未分化状态，使得它对许多环境力因素特别敏感。考虑到三羟异黄酮的雌激素/抗雌激素双向作用，孕期使用会对雌性后代的乳腺发育及肿瘤发生带来何种影响值得研究。p53是53 kDa的核磷酸，它参与细胞周期G0～G1期的转变，并从G1期生长限制性位点调控细胞进入细胞增殖周期，其中p53突变型在癌变中起重要作用，并且常规免疫组化方法只能检出突变型p53蛋白，突变型p53蛋白失去了抗癌活性，它与DNA结合的亲和力下降，抑制细胞增殖能力减弱[6]。

    本实验结果显示孕期注射高剂量三羟异黄酮可使乳腺肿瘤潜伏期的延长、肿瘤发生例数下降，并且可以降低子代小鼠乳腺肿瘤中p53的阳性表达水平，减少了p53基因突变的数量，提示妇女孕期食用富含异黄酮的食物可能预防后代乳腺癌的发生，与流行病学调查结果相符，为预防乳腺癌提供了新的研究思路。

【参考文献】  　　[1] Kerrie B,Bouker,HilakiviClarke L.Genistein: Does it prevent or promote breast cancer? [J].Environ Health Perspect，2000，108: 701-708.

　　[2] Hilakivi Clarke L,Cho E,Onojafe I,et al.Maternal exposure to genistein during pregnancy increases carcinogen induced mammary tumorigenesis in female rat offspring[J].Oncol Rep,1999, 6 (5): 1089-1095.

　　[3] Limer JL,Speirs V.Phytooestrogens and breast cancerchemoprevention[J].Breast Cancer Res, 2004, 6(3): 119-127.

　　[4] 曾益新.肿瘤学[M].北京：人民卫生出版社，1999：42-45，191.

　　[5] Pei RJ,Sato M,Yuri T,et al.Effect of prenatal and prepubertal genistein exposure on NmethylNnitrosoureainduced mammary tumorigenesis in female SpragueDawley rats[J].In Vivo,2003, 17(4): 349-57.

　　[6]　Kem SE，Kinzler KW，Baker SJ，et al.Mutant proteins bind DNA abnormally in vitro[J].J Immunol，1987，138：4114-4120.