大肠腺癌组织中p57kip2蛋白和基因的表达及其与临床病理的关系

大肠腺癌组织中p57kip2蛋白和基因的表达及其与临床病理的关系作者：岳辉，台卫平，杨小乔，张 宁，杨 琳，蒋会勇    作者单位：1.510317 广州，广东省第二人民医院消化内科;2.沈阳军区总医院    【摘要】  目的 探讨细胞周期调控抑制因子p57kip2蛋白和基因在大肠腺癌发生发展中的作用。方法 采用免疫组化技术SP法，检测p57kip2蛋白在37例大肠腺癌和26例正常大肠黏膜组织中的表达；采用RTPCR技术，检测p57kip2基因mRNA在32例大肠腺癌和癌旁组织中的表达。结果 p57kip2蛋白阳性表达率在大肠腺癌组织中为40.5%, 显著低于正常大肠黏膜组织(χ2=5.039,P<0.05)，并与大肠腺癌组织分化程度和淋巴结转移均有关(χ2=8.914,χ2=4.416，P<0.05)；p57kip2基因mRNA阳性表达率在大肠腺癌组织中为34.4%, 显著低于癌旁大肠黏膜组织(χ2=4.016,P<0.05)，并与大肠腺癌组织分化程度、淋巴结转移无关；大肠腺癌组织p57kip2基因mRNA表达水平显著低于癌旁组织（P<0.05）。结论 p57kip2蛋白的低表达与大肠腺癌的发生发展有关，p57kip2基因mRNA的低表达与大肠腺癌的发生有关，且p57kip2基因mRNA的低表达可能是p57kip2蛋白低表达的原因之一。    【关键词】  p57kip2蛋白;p57kip2基因mRNA;大肠腺癌    Expression of p57kip2 Protein and p57kip2 mRNA in Human Colorectal Adenocarcinoma and Their Clinicopathological Correlation    YUE Hui1, TAI Weiping1，YANG Xiaoqiao1，ZHANG Ning2, YANG Lin2, JIANG Huiyong2 1.Department of Gastroenterology，The Second People’s Hospital of Guangdong Province, Guangzhou 510317，China;2.General Hospital of Shenyang Military RegionAbstract：Objective  To investigate the effects of inhibiting factor of cell cycle regulation p57kip2 protein and gene in the genesis and progression of human colorectal adenocarcinoma.Methods  The expressions of p57kip2 protein in tumor tissues of 37 patients with colorectal adenocarcinoma and in normal colorectal mucosal tissues of 26 subjects were detected by SP immunohistochemical technique. The expressions of p57kip2 gene mRNA in tumor tissues and adjacent colorectal tissues of 32 patients were detected by RTPCR.Results  p57kip2 protein positiveexpression rate in tumor tissues of colorectal adenocarcinoma was 40.5%, which was lower than that in normal colorectal mucosal tissues (χ2=5.039,P<0.05)，p57kip2 protein positiveexpression correlated significantly with tumor cell differentiation and lymph node metastasis (χ2=8.914,χ2=4.416,P<0.05)； p57kip2 gene mRNA positiveexpression rate in tumors of colorectal adenocarcinoma was 34.4%, which was lower than that in adjacent colorectal mucosal tissues (χ2=4.016,P<0.05), and was not correlate remarkably with tumor cell differentiation, lymphy node metastasis; the expression level of p57kip2 gene mRNA in tumor tissue was lower than in adjacent corlorectal mucosal tissues (P<0.05).Conclusion  The decreased expression of p57kip2 protein may play an important role in the genesis and progression of colorectal adenocarcinoma. The decreased expression of p57kip2 gene mRNA may contribute to the  occurrence of colorectal adenocarcinoma. The decreased expression of p57kip2 protein may relate with the decreased expression of the expressions of p57kip2 gene mRNA.    Key words：p57kip2 protein；p57kip2  gene mRNA；Human colorectal adenocarcinoma     细胞周期调控异常是细胞过度增殖和肿瘤发生的重要原因[1]。正常的细胞周期G1期进程是由一系列的细胞周期蛋白（cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclindependent kinases，CDKs）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（cyclindependent kinase inhibitors, CDKIs）来调控的，作为CDKIs，负性调控细胞周期蛋白和细胞周期蛋白激酶复合物活性的两个主要家族，INK4和CIP/KIP家族已经被报道。CIP/KIP家族包括p21、p27和p57蛋白，它们通过与CDKs结合及抑制CDKs的功能使细胞周期俘获在G1期[2]。但细胞周期G1/S期调控因子p57kip2蛋白及基因表达与大肠腺癌关系的研究在国内少见报道，本研究采用免疫组化SP法检测p57kip2蛋白在大肠腺癌组织和大肠正常黏膜组织中的表达，采用RTPCR技术，检测p57kip2基因mRNA在大肠腺癌和癌旁组织中的表达，旨在探讨两者在大肠腺癌的发生发展中的作用及其与临床病理的关系。1  资料和方法    1.1  病例和大肠腺癌及对照组织标本    收集1999年12月～2001年12月沈阳军区总医院手术切除标本大肠腺癌37例，男21例，女16例，平均年龄59.9岁(26～72岁)，所有病人术前均未经放疗、化疗，其中高分化大肠腺癌14例，中低度分化大肠腺癌23例，15例有淋巴结转移。收集经大肠镜检查得到的正常大肠黏膜活检标本26例，其中男15例，女11例，平均年龄59.5岁(24～80岁)。以上均经病理学诊断证实。所有标本均经福尔马林固定，石蜡包埋。收集沈阳军区总医院2000年10月～2002年1月手术切除大肠腺癌标本32例，男19例，女13例，平均年龄58.75岁(29～76岁)，所有病人术前均未接受放疗、化疗，其中高分化大肠腺癌12例，中低分化大肠腺癌20例，16例有淋巴结转移，Dukes分期：A+B期18例，C期14例，以上病例均经病理学证实，所有标本术后立即分别在癌灶中央和距癌组织边缘5.0 cm以外的癌旁黏膜组织处取材，各取4块，进行分类编号后的标本放入EP管中，立刻投入液氮中冻存。    1.2  免疫组织化学方法    将福尔马林固定石蜡包埋的组织制备成4 μm厚连续切片并用多聚赖氨酸包被切片，用做免疫组织化学研究。p57kip2蛋白表达检测采用免疫组化技术SP法, 使用抗p57kip2鼠抗人单克隆抗体(57P06)和SP试剂盒（UltraSensitiveTM kit9720）。脱蜡的切片在EDTA修复液中以高温高压行抗原修复并与相应的抗体4℃孵育过夜，对于免疫组化染色按照UltraSensitiveTMSP试剂盒说明书进行操作，所有的试剂均购自中国福州迈新生物技术公司。p57kip2蛋白以胞核或胞质染色为棕褐色颗粒者为阳性反应细胞，400倍显微镜下每张载玻片计数500个细胞，依据染色阳性细胞所占细胞总数的百分比，将结果分为阴性（-）：标本中无阳性反应细胞或<10%；阳性（+）：按标本中阳性细胞所占细胞的百分比分为：（+）10%～25%，（++）>25%～50%，（+++）>50%。    1.3  RTPCR方法    液氮冻存标本复融后，分别取大肠癌和相应的癌旁大肠黏膜组织，提取总RNA（总RNA分离试剂盒，Code No.MK0042,华美生物工程公司）；配制反转录cDNA的合成体系合成RTcDNA（反转录试剂盒，Code No.RR023CA，大连宝生物工程公司）；分别取p57kip2 RTcDNA和其PCR引物及TagDNA聚合酶（TaKaRa TagTM）配制PCR扩增体系扩增p57kip2基因cDNA，以上均按说明书操作。其中反转录PCR的温度和时间为：65℃ 1 min→30℃ 5 min→30℃～65℃ 15～30 min→98℃ 5 min→5℃ 5 min合成p57kip2反转录cDNA；采用Genefisher软件设计p57kip2引物序列（产物长度为500 bp）：5′CGTTCTTCTCGGGTGGA3′(Forward Primer), 5′CTGTACTCACTTGGCTCA3′(Reverse Primer)（上海生工生物技术公司合成），内参照βactin引物序列（产物长度为690 bp）：5′TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC3′ (Forward Primer)，5′ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG3′(Reverse Primer)(北京奥科生物技术有限公司合成)；p57kip2基因cDNA PCR 扩增循环条件：94℃4 min→94℃40 s→55℃1 min→72℃1 min→72℃27 min，共32个循环，参照Schwaller J研究工作的循环条件[3]。PCR扩增产物与内参标记物βactin以及ΦX174HincII digest DNA Maker 在2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，p57kip2在500 bp处有亮带出现者为p57kip2mRNA表达阳性，否则p57kip2mRNA表达阴性；用电泳凝胶成像自动分析系统检测各扩增带产物的含量，被测基因mRNA相对含量（或表达水平）为：被测基因mRNA的密度/βactin mRNA的密度×100。    1.4  统计学方法    SAS System（Release 6.12）和Microsoft Excel统计软件包, χ2检验、确切概率法和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。2  结果    2.1  p57kip2蛋白在大肠腺癌组织中的表达及与临床病理的关系    p57kip2蛋白定位于正常大肠黏膜细胞和阳性病例的大肠腺癌细胞核或胞质中，呈较细的棕褐色颗粒，但以细胞核染色为主。大肠腺癌组织中p57kip2蛋白阳性表达率显著低于正常大肠黏膜组织（χ2=5.039, P<0.05），中低分化大肠腺癌组织p57kip2蛋白阳性表达率显著低于高分化者（χ2=8.914, P<0.05），淋巴结转移组p57kip2蛋白阳性表达率显著低于无淋巴结转移组（χ2=4.416，P<0.05），见表1。表1  p57kip2蛋白在大肠腺癌组织中的表达    2.2  p57kip2mRNA在大肠腺癌和癌旁组织中的表达及与临床病理的关系    p57kip2基因mRNA在大肠腺癌组织中阳性表达率显著低于癌旁大肠黏膜组织（χ2=4.016,P<0.05），即在p57kip2基因转录水平上大肠腺癌组织p57kip2mRNA与癌旁组织比较已经有降低,但p57kip2mRNA阳性表达与大肠腺癌组织分化程度、淋巴结转移均无相关性（P＞0.05），见表2。表2  p57kip2mRNA在大肠腺癌组织中的表达    2.3  p57kip2基因mRNA在大肠腺癌和癌旁组织中表达水平的比较    p57kip2基因mRNA在大肠腺癌组织中表达水平显著低于癌旁大肠黏膜组织（P<0.05）, 见表3； p57kip2  在大肠癌组织和癌旁组织中的mRNA表达，见图1  。表3  p57kip2基因mRNA在大肠腺癌和癌旁组织中表达水平的比较3  讨论    p57kip2蛋白是细胞周期负性调控因子，其基因定位于11p15.5染色体，为p57kip2基因的表达产物，属CIP/KIP家族，与p21、p27功能相似。Lee等[4]认为p57kip2基因在肿瘤的发生发展中起着重要作用，而且其抑癌作用可能是其产物p57kip2蛋白与cyclinCDK复合物结合，阻止细胞增殖，从而使细胞周期停滞在G1期。Matsumoto等[5]在2000年报道采用免疫组化技术研究92例食管鳞状细胞癌p57kip2蛋白阳性表达率为（43.3±3.2）%，并认为该研究是第一次采用免疫组化技术对p57kip2蛋白在非肿瘤性食管上皮和食管鳞状细胞癌组织中表达进行了研究，从那以后，一些关于p57kip2蛋白在肝癌、甲状腺癌组织中表达的研究被报道[67]。而p57kip2蛋白与大肠腺癌发生发展的关系很少报道[8]。本结果显示大肠腺癌组织中p57kip2蛋白表达阳性率显著低于正常大肠黏膜组织，大肠腺癌组织中p57kip2蛋白表达强度随着恶性程度的增高和淋巴结转移而降低，提示p57kip2蛋白的表达降低与大肠腺癌的发生、恶性程度和淋巴结转移均有关。Kondo等[9]认为在正常情况下p57kip2基因的父源基因被印记，母源基因被表达，在肿瘤中p57kip2基因的印记缺失和印记错误导致了p57kip2基因表达水平的降低。本研究结果显示大肠腺癌组织中p57kip2基因mRNA阳性表达率及表达水平均显著低于癌旁大肠黏膜组织，但p57kip2基因mRNA在大肠腺癌组织中表达强度与恶性程度的增高及淋巴结转移无相关性，提示p57kip2基因mRNA低表达与大肠腺癌的发生有关，而与大肠腺癌的恶性程度及淋巴结转移无关。Loda等[10]检测了149例人原发性结肠癌的p27kip1蛋白表达水平，分析了p27kip1蛋白表达和降解，发现p27kip1蛋白表达水平低或无的结肠癌表现出p27kip1增强的水解酶活动，提示p27kip1蛋白低表达是由于蛋白水解酶介导的降解活动增加而不是基因表达降低，即在大肠癌组织中存在着p27kip1蛋白低表达的转录后机制。本研究结果显示p57kip2基因mRNA在大肠腺癌组织与癌旁正常大肠组织中的表达水平有显著差异，即p57kip2基因在大肠腺癌组织中的表达水平在转录水平上已有下降，而与p27kip1有所不同，且p57kip2基因的表达下降可能是该蛋白表达降低的原因之一。    综上所述，研究结果表明，p57kip2蛋白表达降低可能有助于大肠腺癌发生发展。p57kip2基因mRNA的低表达与大肠腺癌的发生有关，且p57kip2基因mRNA的低表达可能是p57kip2蛋白低表达的原因之一。【参考文献】［1］ Clurman BE, Roberts JM. 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