食管癌细胞NGAL基因416～+84区段存在TPA反应元件

作者：许丽艳    作者单位：100022 北京工业大学生命科学与生物工程学院病毒与药理研究室

【摘要】  目的 本文旨在对NGAL基因启动子区及其附近是否存在TPA反应元件进行研究。方法 (1） 采用PCR法从食管癌细胞中克隆NGAL基因5′侧翼区416～+84片段，然后分别插入质粒pGLB和pGLE， 构建pGLB416和 pGLE416荧光素酶报告基因表达载体； (2） 将pGLB416和 pGLE416分别同pRLTK共转染食管癌细胞EC109；(3） 用TPA刺激转染的EC109， 检测细胞相对荧光素酶活力，通过相对荧光素酶活力变化判定NGAL基因5′侧翼416～+84区是否存在TPA反应元件， 同时进行生物信息学分析。 结果 无论是pGLB416还是 pGLE416， 与pRLTK共转染食管癌细胞EC109后，用TPA刺激，与其相应的空载体相比，转染细胞荧光素酶活力均极显著升高(t检验，P<0.01)，约分别升高46.82和46.41倍；而TPA刺激组与没有TPA刺激组相比，pGLB416和pGLE416转染EC109细胞荧光素酶活力分别显著升高了5.17倍和7.37倍 (t检验，P<0.01)。生物信息学分析显示，NGAL基因5′侧翼416～+84区段至少存在4个潜在的TPA反应元件。结论 食管癌细胞NGAL基因5′侧翼416～+84区段存在着TPA反应元件。

【关键词】  NGAL基因 食管癌细胞 基因表达调控 TPA反应元件

   0  引言

    NGAL（Neutrophil GelatinaseAssociated Lipocalin）基因是lipocalin家族的一个新成员，全长5 869bp，包括7个外显子，位于染色体9q34区域，单拷贝，蛋白编码区长度591bp，编码197个氨基酸。近年有研究证明，NGAL基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶9（Matrix Metalloproteinase9，MMP9）的活性，以及作为小分子铁化合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能[13]。我们以往研究发现，在TPA（12otetradecanoylphorbol13acetate）诱导永生化食管上皮细胞癌变过程中NGAL基因过表达[4]。这提示在食管癌细胞NGAL基因转录调控区可能存在着某种TPA反应元件，但具体位置尚不清楚。为此，本文通过双荧光素酶报告基因检测系统对NGAL基因5′侧翼416～+84区片段的TPA反应性进行研究，主要目的是检测NGAL基因启动子区及其附近是否存在TPA反应元件。这将有助于深入到分子水平揭示食管上皮细胞癌变过程中NGAL基因过表达机制。现将有关实验方法与结果报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  细胞与细胞培养  食管癌细胞系EC109由中国医学科学院肿瘤研究所林晨研究员惠赠。使用199培养基（Invitrogen），在常规条件下传代培养。

    1.2  细菌菌株、质粒及主要试剂  JM109细菌菌株、萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pGL3Basic(pGLB)和pGL3Enhancer（pGLE）、海肾荧光素酶报告基因表达载体pRLTK（内参照质粒）、双荧光素酶报告基因分析系统均购自美国Promega公司；转染试剂Fugene 6 reagent购自德国Roch公司。质粒提取试剂盒购自德国QIAGEN公司。实验质粒pGLB416和pGLE416，采用PCR法从食管癌细胞SHEEC(在TPA作用下,由永生化食管上皮细胞恶变而来[5])中克隆出NGAL基因5′侧翼区416～+84片段，分别插入到质粒pGLB和pGLE的XhoⅠ和BglⅡ 双酶切位点，测序鉴定。

    1.3  瞬时转染与TPA诱导实验  采用QIAGEN公司质粒提取试剂盒分别提取实验质粒pGLB416和pGLE416、对照质粒pGLB和pGLE以及内参照质粒pRLTK，并测定各质粒含量。质粒转染步骤参照文献[6]进行。转染后24h，加入终浓度为5ng/ml的TPA（Sigma公司）进行诱导。继续培养24h后，收获细胞。每组实验样品3个实验孔，并至少进行3次重复实验。

    1.4  双荧光素酶活性检测  双荧光素酶活性（DLR）检测按照双荧光素酶报告基因分析系统（Promega公司）操作手册及文献[6]所述方法，在TD20/20照度计（Turner Designs 公司）上进行。

    1.5  统计学分析  根据TD20/20型照度计配置的软件包计算出各组相对荧光强度（萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶），以此代表荧光素酶活力。各组实验数据均计算平均值及标准差。应用SPSS 10.0对各组实验数据之间是否有显著性差别进行t检验。

    1.6  生物信息学分析  应用转录因子数据库（http://www.generegulation.com）中的软件AliBaba2.1分析预测NGAL基因5′侧翼416～+84区段潜在的TPA反应元件序列及其位点。相关参数分别为:Pairsim to known sites：64，Match width in bp：10，Min num of sites：5， Min match Conservation：80％。

    2  结果

    2.1  pGLB416或pGLE416的表达活性及TPA反应性

    2.1.1  pGLB416的表达活性及TPA反应性

    有关实验结果见图1-A。从中可见: (1）在没有TPA作用下，与转染空载体pGLB相比，转染pGLB416的食管癌细胞EC109的相对荧光素酶活力极显著升高 (t检验， P<0.01)，约升高6.42倍。(2） 在5ng/ml TPA作用下，与转染空载体pGLB相比，转染pGLB416的食管癌细胞EC109的相对荧光素酶活力升高更显著 (t检验， P<0.01)，约升高46.82倍。(3）转染pGLB416的食管癌细胞EC109，TPA作用（5ng/ml）与没有TPA作用相比，前者的相对荧光素酶活力极显著升高(t检验， P<0.01)，约升高5.17倍。上述实验结果提示，NGAL基因5′侧翼416～+84区段是启动子所在部位，启动基因表达的基础水平很高，而且具有明显的TPA反应性，说明在NGAL基因5′侧翼416～+84区段存在较强的TPA反应元件。

    2.1.2  pGLE416的表达活性及TPA反应性

    有关实验结果见图1-B。从中可见: (1）在没有TPA作用下，与转染空载体pGLE相比，转染pGLE416的食管癌细胞EC109的相对荧光素酶活力极显著升高 (t检验， P<0.01)，约升高32.25倍。(2）在5ng/ml TPA作用下，与转染空载体pGLE相比，转染pGLE416的食管癌细胞EC109的相对荧光素酶活力升高更显著(t检验， P<0.01)，约升高46.41倍。(3）转染pGLE416的食管癌细胞EC109，TPA作用（5ng/ml）与没有TPA作用相比，前者的相对荧光素酶活力极显著升高(t检验， P<0.01)，约升高7.37倍。上述实验结果表明，NGAL基因启动子元件接受增强子作用，与之协调的能力是很强的，而且表现出明显的TPA诱导特性。

    2.2  pGLB416与pGLE416 TPA反应性的比较

    有关实验结果见图2。从中可见: (1）无论是否有TPA作用，与转染pGLB416相比，转染pGLE416的食管癌细胞EC109的相对荧光素酶活力均极显著升高（t检验， P<0.01），约分别升高5.77（没有TPA作用）和7.17（有TPA作用）倍。(2）转染pGLE416的食管癌细胞EC109的相对荧光素酶活力，有TPA作用与没有TPA作用之间的差值为48.35(55.85～7.50)；相对而言，转染pGLB416的则为6.69 (7.79～1.30)，不足前者的1/7。这表明在TPA作用下，与转染pGLB416相比，转染pGLE416的食管癌细胞EC109的相对荧光素酶活力升高的幅度要大得多。这些实验结果提示，在体现应答TPA刺激时NGAL基因启动子的作用在增强子协助下会显著增强。

    无论是否有TPA作用，与转染pGLB416相比，转染pGLE416的食管癌细胞EC109的相对荧光素酶活力均极显著升高（t检验， P<0.01）。上述相对荧光素酶活力检测实验方法同图1。

    2.3  生物信息学分析结果

    应用转录因子数据库（http://www.generegulation.com）中的软件AliBaba2.1， 对NGAL基因 5′侧翼416～+84区段潜在的TPA反应元件序列及其位点的分析预测结果见图3。从中可见，在NGAL基因5′侧翼416～+84区段贯穿整个序列共存在4个潜在的同一类型TPA反应元件序列。这表明，NGAL基因在DNA序列上存在着应答TPA刺激的结构基础。

    3  讨论

    我们以往研究发现，NGAL基因在人食管上皮细胞癌变中显著过表达[4]，具有促进癌细胞侵袭的功能[7]，同时可能还在癌细胞的不良分化中发挥作用[8]。这些研究结果提示，NGAL基因可能是人类的一个重要的新癌基因，但在食管癌等肿瘤细胞中过表达调控的机制不明。

    近年，Cowland等[9]研究发现，在Ⅱ型肺泡上皮细胞A549培养液中加入细胞因子IL1β可诱导NGAL基因表达上调10倍以上。而Gombart等[10] 则研究发现，C/EBPε因子(增强子元件CCAAT特异性结合蛋白因子)缺陷鼠中性粒细胞NGAL基因的转录减弱。这些实验结果提示，IL1β和C/EBPε等因子的作用分别与Ⅱ型肺泡上皮细胞和中性粒细胞中NGAL基因的表达相关。然而，我们最近的研究结果表明，在食管癌细胞中，NGAL基因的转录与IL1β和C/EBPε等因子的作用均没有关系（另文发表）。这提示在食管癌等肿瘤细胞中可能存在着另外一种机制控制着NGAL基因的转录。以往我们曾研究证明NGAL基因的启动子位于其5′侧翼-152～＋84区段[11]，而通过本文的实验结果来看，在NGAL启动子及其附近区域（-416～＋84）存在着TPA反应元件。这说明TPA是导致食管癌细胞NGAL基因过表达的一种调节因素。推测TPA可能是通过细胞内信号传递途径激活了某种TPA反应元件结合蛋白，导致NGAL基因过表达。

    pGLB和pGLE是两种不同性质的萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。pGLB空白载体上无任何的启动子或增强子等基因转录调控元件。把NGAL基因5′侧翼-416～＋84区段DNA插入pGLB，主要目的就是要考查NGAL基因的这一区段DNA启动基因表达的基础水平。pGLE空白载体上插有一个强增强子，即SV40大T抗原基因的增强子。把NGAL基因5′侧翼-416～＋84区段DNA插入pGLE，主要目的就是要考查NGAL基因启动子区DNA接受增强子作用的能力，评价NGAL基因表达的诱导特性。综合本文研究所获得的各项实验结果来看，NGAL基因5′侧翼区-416～+84这一区段DNA，启动基因表达的基础水平很高，接受增强子作用的能力很强，且表现出非常明显的TPA诱导特性。

    关于TPA反应元件，较早就有研究报道，但效应细胞种类不同，TPA反应元件的序列会有很大变化。迄今被研究报道的TPA反应元件主要有如下三种类型：①AP1复合因子结合型[12]，元件典型序列为TGA(C/G)TCA， ② GATA家族蛋白结合型[13]，元件典型序列为GATA box，③ Sp1样家族蛋白结合型[14]，元件典型序列为 GGGGCGGGGC。生物信息学分析发现，在NGAL基因-416～+84区段存在4个Sp1型TPA反应元件，但究竟是哪一个或几个在实际中发挥作用，以及是否存在新的TPA反应元件，均需进一步实验鉴定。最近，我们联合运用定点突变、双荧光素酶报告基因检测系统和凝胶滞留等实验技术手段研究证明，NGAL基因的TPA反应元件位于其5′侧翼-95/-94左右，并且很可能是一种新结构类型形式，而EC109食管癌细胞核内也的确存在着某种核蛋白因子能够与NGAL基因这一区域的相应片段（-107～-82）相结合（另文发表）。

    总之，在NGAL基因-416～+84区段发现存在TPA反应元件是十分有意义的。这既有助于深入到分子水平揭示为什么食管上皮细胞癌变中NGAL基因过表达，同时也有助于进一步认识TPA细胞信号传递途径网络在肿瘤发生发展中的作用机制。

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