靶向HER2 mRNA反义硫代寡核苷酸体外抗乳腺癌活性研究

作者：孙君重    作者单位：100039 北京, 中国人民解放军总医院第304临床部

【摘要】  目的 研究以HER2 mRNA为靶点的反义硫代脱氧寡核苷酸（SODNs）HA6722对HER2过表达乳腺癌细胞株MDAMB453体外增殖的抑制作用，及HA6722对肿瘤细胞HER2表达的影响。方法 选择HER2过表达的MDAMB453细胞与HER2低表达的MDAMB231细胞，MTT法观察SODNs对肿瘤细胞增殖的影响，免疫细胞化学（ICC）与RTPCR方法研究SODNs对细胞HER2蛋白及mRNA表达的影响。结果 HA6722可以剂量依赖方式抑制MDAMB453细胞的体外增殖，IC50值（41.8±8.1nmol·L-1, n=5, mean±s）显著低于对照序列Scramble6722（IC50=489.4±12.1nmol·L-1, n=5, P<0.01）。HA6722在蛋白水平与mRNA水平显著抑制MDAMB453细胞中HER2的表达；HA6722对MDAMB231细胞的体外增殖无显著影响（IC50=476.7±17.6 nmol·L-1, n=5，P＞0.05）。结论 HA6722可序列特异性地抑制HER2过表达乳腺癌细胞的体外增殖，其抑制增殖作用与靶细胞HER2表达下调有关。

【关键词】  反义 寡核苷酸 乳腺癌 HER2 mRNA

   0  引言

    乳腺癌的发生、发展涉及多基因的异常。HER2/neu（又称CerbB2）基因的异常扩增见于30%左右的乳腺癌患者。现已明确，HER2/neu基因的异常扩增或HER2受体的过表达是一种不良的预后指标[1]。反义疗法是在转录水平以反义寡核苷酸特异性结合靶mRNA，激活RNase H，降解mRNA, 阻断相应功能蛋白的表达。有研究表明[2，3], 反义寡核苷酸可以抑制HER2受体的表达，进而抑制乳腺癌细胞的增殖。本研究采用本研究室设计合成的HER2特异性硫代反义寡核苷酸HA6722，观察了其对不同HER2表达水平的乳腺癌细胞株增殖活性的影响，并在mRNA和蛋白水平观察了其对HER2的影响。

    1  材料与方法

    1．1  细胞系及培养

    本研究采用的细胞株有：MDAMB453（HER2过表达），细胞培养所需的培养基为L15（Gibco,BRL）内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone），置37℃、不含CO2的培养箱中培养；MDAMB231（HER2低表达）的体外培养采用RPMI1640（Gibco,BRL）培养基，内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone）,置37℃、含体积分数为5%的CO2培养箱中培养传代。

    1．2  硫代反义寡核苷酸的合成

    靶向HER2 mRNA反义寡核苷酸HA6722、Scramble6722序列均为含20个核苷酸的寡聚核苷酸，全程硫代修饰，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。序列如下：

    HA6722：   5′CAG CAG CCG AGC CAG CCC GA3′

    Scramble:    5′TCG GGC TGG CTC GGC TGC TG3′

    琼脂糖凝胶电泳结果表明上述反义寡核苷酸纯度符合要求。上述反义寡核苷酸以无血清无抗生素的L15或RPMI1640培养基溶解成浓度为25μmol·L－1的溶液，过滤除菌，-20℃储存，临用时稀释至所需浓度。

    1．3  噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）法检测细胞活性  取对数生长期的上述细胞，以不同数量接种96孔培养板（Costar,USA）,接种数量分别为：MDAMB453  5×104cells/孔、MDAMB231  2×104cells/孔，为避免“周边效应”，培养板的周边孔弃用。待细胞生长至80%～90%融合时，用脂质体2 000将不同浓度的HA6722, Scramble6722等硫代寡核苷酸转染细胞4～6h，随后继续培养24～72h，倾去培养液，加新鲜配置的MTT溶液（0.5mg/ml）200μl, 细胞在37℃，含有5 %（MDAMB453细胞的培养不需CO2）的培养箱中继续孵育4h，吸去MTT溶液，每孔加200μl  DMSO, 轻轻震荡20～30min，酶联仪测定光吸收值（OD值）。

    1．4  免疫细胞化学

    以脂质体（LipofectamineTM 2000, Invitrogen）2000将终浓度为200 nM 的HA6722, Scramble6722对照序列转染MDAMB453及MDAMB231 36h后，以免疫组化方法检测HER2受体表达。具体方法见免疫组化试剂盒操作说明（中山公司）。简言之，将细胞涂片在枸橼酸缓冲液(6.4M枸橼酸二钠，pH 6.0)中以 95℃ 15min进行抗原修复，室温下冷却20min，用Tris 缓冲液（pH 7.6）冲洗涂片3min×3次，然后过氧化氢室温封闭5min，再按上述方法洗涤。涂片在37℃下用HER2单克隆抗体(鼠抗人，Santa Cruz, USA)孵育60min，再用二抗 (羊抗鼠，Santa Cruz, USA)以同样的条件孵育30min。 用缓冲液冲洗切片3min×3次，再用铬精底物溶液(3, 3’二氨基联苯胺)进行核染色。最后以苏木精染色计算着色深度。着色深度分为0 (基本等同于阴性染色), 1+ (轻度着色), 2+ (中度着色)及3+ (重度着色)。

    1．5  逆转录多聚酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RTPCR）

    以浓度为200nmol·L-1的 硫代反义寡核苷酸HA6722、Scramble6722序列分别转染MDAMB453、MDAMB231乳腺癌细胞24小时后，遵照试剂说明书（RNA RTPCR试剂盒，广州 璐晶）提取细胞总RNA，Backman紫外分光光度计测定光吸收值（OD值），计算RNA含量。人类特异的HER2及内标(glyceraldehydes-3-phosphate，G3PDH) 引物如下：

    HER2  上游：   5’CAA TGG AGA CCC GCT GAA C3’;  下游: 5’CAG TGC GCG TCA GGC TCT  3’

    G3PDH  上游:   5’ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3’; 下游:   5’TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3’

    引物由北京赛百盛公司合成。反应条件为：反转录及第一次循环：预变性1循环 55℃ 30min， 94℃ 2min；PCR  30个循环：94℃  25sec，56℃ 30，72℃ 35sec；产物扩增及第二次循环：94℃ 1min；PCR 30个循环：94℃ 25sec，56℃ 30sec，72℃ 35sec；最后是2min的延伸。反应产物在1.2%的琼脂糖 (Gibco) 凝胶中进行电泳，之后在紫外灯下扫描拍照；上述细胞在不经硫代反义寡核苷酸转染的情况下，分别提取RNA，按同样方法操作，以检测HER2 mRNA的基础表达水平。

    1．6  统计学处理

    采用SPSS10.0统计分析软件进行统计学处理，均数比较采用Student’s t检验。

    ２  结果

    2．1  HA6722及其对照Scramble6722对MDAMB453及MDAMB231细胞系的IC50比较,见表1。

    2．2  HA6722及其对照对两种细胞增殖活性的影响表1  HA6722对两种乳腺癌细胞系的IC50比较与HA6722 MDAMB453相比，t=74.3, P＜0.05; △与Scrambl6722相比，t=1.33, P＞0.05    不同浓度HA6722、Scramble6722作用于对数生长期的细胞72h之后，前者可以显著抑制HER2过表达细胞MDAMB453细胞的增殖，而且此种作用随着浓度的增加而增强；同样浓度的HA6722对HER2低表达的MDAMB231细胞却没有相应的抑制作用, 见图1。

    2．3  HA6722对MDAMB453细胞HER2受体表达影响

    免疫细胞化学方法显示，经80～200nmol·L－1浓度HA6722处理24～48h后，MDAMB453细胞HER2蛋白水平呈现明显的下调，从基础水平的3+染色减低到200nmol·L－1浓度处理后几乎阴性的状态,见图2。

    2．4  HA6722对MDAMB453细胞HER2 mRNA表达影响

    RTPCR方法显示，经HA6722处理后，MDAMB453细胞HER2 mRNA呈现下调趋势，而且随着HA6722浓度增加，这种下调越趋明显，当HA6722浓度达到200nmol·L－1时，HER2 mRNA几乎受到了完全的抑制，而对照寡核苷酸Scramble及Random对HER2 mRNA的表达几乎没有影响, 见图3、4。

    3  讨论

    HER2/neu的过表达与乳腺癌的生物学行为关系十分密切。有研究表明，以HER2 mRNA为靶点的反义寡核苷酸可以特异性抑制HER2/neu过表达乳腺癌细胞的生长，甚至比HER2受体的单抗更为强大[4]。针对不同基因的反义药物研究，近年来呈现快速发展的趋势，并显示出诱人的发展前景[5]。以bcl2等基因为靶点的反义药物已有大量的研究，如G3139已在体外及体内研究中均显示出明确的抗肿瘤作用[6，7]，并可增强细胞毒药物的抗肿瘤效果[8]

    有作者发现，以HER2为靶点的反义寡核苷酸HA824对HER2过表达乳腺癌细胞SKBR3体外增殖具有抑制作用[9]。是否具有序列特异性抑制肿瘤细胞生长的作用，是衡量反义药物优劣的重要指标。本研究中，我们以另一种HER2过表达乳腺癌细胞株MDAMB453细胞为对象，对本研究室设计合成的反义寡核苷酸HA6722进行体外抗乳腺

    癌增殖作用及其机理的研究。结果表明，HA6722对HER2/neu过表达乳腺癌细胞MDAMB453细胞的抑制呈现良好的剂量依赖性，而对HER2/neu低表达的MDAMB231细胞却没有相同的作用。

    HER2/neu过表达乳腺癌细胞的生长有赖于持续高水平的HER2受体激活，而HER2受体的下调将阻断细胞生长的信号传导通路。本研究表明HA6722对MDAMB453细胞HER2受体及mRNA表达呈现剂量依赖性下调，而具有相同碱基组成的Scramble及随机序列对HER2 mRNA几乎没有影响。

【参考文献】  ［1］ Pegram MD, Finn RS, Arzoo K, et al. The effect of HER2/neu overexpression on chemotherapeutic drug sensitivity in human breast and ovarian cancer cells［J］. Oncogene，1997， 15(5):537547.

［２］ Yang SP, Song ST, Song HF.Advancements of antisense oligonucleotides in treatment of breast cancer［J］. Acta Pharmacol Sin， 2003，24(4):289295.［３］ Weiss RH, Marshall D, Howard L, et al. Suppression of breast cancer growth and angiogenesis by an antisense oligodeoxynucleotide to p21(Waf1/Cip1)［J］. Cancer Lett， 2003，189(1):3948.

［４］ Roh H, Pippin JA, Green DW, et al.Oncolgene［J］． 2000， 19(53):61386143.

［５］ Pirollo KF, Rait A, Sleer LS, et al. Antisense therapeutics: from theory to clinical practice［J］. Pharmacology ＆ Therapeutics， 2003, 99(1):5577.

［６］ Nahta R, Esteva FJ. bcl2 antisense oligonucleotides: a potential novel strategy for the treatment of breast cancer[J]. Semin Oncol,2003,30(5 Suppl 16):143149.

[7] Morris MJ, Tong WP, CordonCardo C, et al. Phase Ⅰtrial of bcl2 antisense oligonucleotide(G3139) administered by continuous intravenous infusion in patients with advanced cancer［J］.Clin Cancer Res，2002，8(3):679683.

［8］ Tanabe K, Kim R, Inoue H, et al.Antisense bcl2 and HER2 oligonucleotide treatment of breast cancer cells enhances their sensitivity to anticancer drugs［J］. Int J Oncol， 2003，22(4):875881.

［9］ 杨栓平，宋海峰，宋三泰，等．靶向HER2 mRNA反义寡核苷酸对SKBR3乳腺癌细胞Caspase3蛋白表达的影响［J］．中国药理学通报，2003，19（5）：505507．