血管窦内皮细胞改变在肝癌组织缺血再灌注损伤中的作用

【摘要】  目的 研究肝癌组织缺血再灌注后血管窦内皮细胞（Sinusoidal endothelial cells，SEC）的损伤。方法 兔肝脏注射VX2肿瘤组织混悬液，建立肝脏肿瘤和缺血再灌注模型。测定再灌注各时点组织中超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮（NO）的含量；用HE和荧光脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）染色观察和比较两种组织中SEC的凋亡情况。结果 缺血再灌注后癌组织中的SOD浓度下降显著,于再灌注1 h即达最低水平(64.59±4.97)，其后逐渐恢复但至再灌注7d仍低于再灌注前(121.12±6.88)。NO浓度在肝癌组织和正常肝组织均有下降。肝癌组织缺血再灌注后SEC凋亡细胞数量明显增加，至1 d时达最高水平54(3.2)。至再灌注7d时阳性细胞仍多于缺血再灌注前33(4.9)，其凋亡细胞数量多于正常肝组织。结论 SEC的改变在肝癌组织缺血再灌注后的损伤过程中起重要作用。肝癌组织的改变较正常肝组织更为显著。

【关键词】  肝肿瘤 再灌注损伤 凋亡 兔

   0  引言

    研究发现,肝脏及肝脏肿瘤缺血再灌注后可造成明显的损伤,其主要原因是氧自由基的产生增加和细胞凋亡［1,2］。研究证明，肝脏肿瘤的生长必须依赖于血管的生成。肝脏肿瘤的消长和自身血管的增殖与凋亡有密切关系［3］。在相关研究中发现,除氧自由基对肝癌细胞的直接损伤外，缺血再灌注对与肝癌组织生长密切相关的微血管是否造成损伤及对肝癌细胞损伤过程中的作用还不清楚。我们在建立肝脏肿瘤组织缺血再灌注模型的基础上，对肝脏肿瘤组织内氧自由基的改变和血管内皮细胞的凋亡进行了观察，为研究肝脏肿瘤组织缺血再灌注损伤的机制和建立肝癌治疗方法打下基础。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    纯种成年新西兰大白兔36只，雌雄不拘，体重2.0～2.5kg，由第四军医大学实验动物中心提供。

    1.2  模型制备及动物分组

    动物分为缺血再灌注前（对照组即假手术组）、缺血再灌注后0min、1h、1d、3d和7d共6个组,每组6只。取VX2瘤株组织块混悬液，超声引导下穿刺肝左中叶，缓慢推注0.5ml制作肝癌动物模型。动物以速眠新肌肉内注射麻醉（0.15ml/kg），开腹后找出接种肿瘤组织的肝左叶，分离供应有癌组织的肝左叶肝动脉分支，用无损伤血管钳阻断动脉血流60min后，松开血管钳恢复动脉血流。按各时间点切取肿瘤组织和正常肝脏组织，部分置－70°C冰箱快速冷冻，部分置固定液固定以备SOD和NO检测和石蜡切片。SOD和NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所。采用721－A型分光光度计。细胞凋亡测试盒购自美国罗氏公司(Roche Diagnostics GmbH)。

    1.3  检测项目及方法

    1.3.1  SOD测试

    按试剂盒要求，设空白管（不加样本）、测定管(含待测组织匀浆、2.0ml 75mmol/L NaHCO3/Na2CO3缓冲液、0.2ml 0.3%TritonX100、0.1ml 0.98mmol/L NBT、0.5ml 15 mmol/L盐酸羟胺和0.1ml蒸馏水)及标准管（不加样本，加0.2ml蒸馏水，其余同测定管）。各管振荡混匀，37℃水浴15min；然后在样品管和标准管内加入1ml甲酸终止反应，充分混匀590nm比色，测SOD值。空白调零，按公式计算组织匀浆中SOD活力：亚硝酸盐单位（NU）／毫克蛋白数（mgprot）＝［2×（样品管吸光度－标准管吸光度）／标准管吸光度］×反应液总体积／(取样量（ml）×组织中蛋白含量)。

    1.3.2  NO和NOS含量检测

    按试剂盒说明书要求制备组织匀浆并测定蛋白含量。同样按照NO说明书要求设定测定管、空白管及标准管，加入相应试剂和待测标本，测定OD值按公式计算NO的含量。

  1.3.3  HE染色

    组织块脱水后石蜡包埋，5μm连续切片,HE染色,光镜下观察。长条状细胞核内染色质致密浓缩，核碎裂及细胞质淡红色等为凋亡细胞。连续观察5个切片，计算凋亡细胞的百分率。

    1.3.4  TUNEL染色

    按照细胞凋亡测试盒的操作流程进行：组织切片二甲苯中脱蜡、经梯度酒精水化、PBS缓冲液振洗后，以蛋白酶K温育30min（37℃），再用PBS振洗3次后，每次5min。切片滴加50μl TUNEL反应液，置湿盒内37℃孵育60min。PBS振洗3次共15min，伊文蓝衬染后，加蛋白甘油液封片，荧光显微镜下观察，照相。胞核内出现黄绿色荧光为阳性细胞。取每个高倍镜视野（×200）计数凋亡细胞。除不滴加TUNEL反应液外，用同样方法和步骤反应进行阴性对照。组织切片标本上滴加DNA酶以裂解DNA，然后按照TUNEL标记步骤依次进行阳性对照。

    1.4  统计学处理

    SOD和NO实验数据以±s表示,凋亡数据以中位数（M）与四分位间距（Q）表示，采用SPSS10.0软件进行统计分析，所用统计方法分别为完全随机分组设计的单变量的多组样本均数的两两比较、Dunnett t检验、KruskalWallis检验、MannWhitney检验及吸引设计的方差分析。

    2  结果

    2.1  SOD和NO改变及血管窦内皮细胞凋亡

    正常肝组织和肝癌组织中SOD从再灌注0min下降，其后虽有所回升但至7d仍明显低于再灌注前。NO浓度从再灌注0min开始下降，其后虽有回升但至再灌注7d仍保持较低水平。HE和TUNEL染色显示，再灌注0min肝脏血管窦内皮细胞凋亡细胞开始增多，至再灌注1～3d保持最高水平,至7d时仍明显高于再灌注前水平。HE和TUNEL染色结果显示肝脏血管窦内皮细胞凋亡规律一致，见表1、2。

    2.2  肝癌组织和正常肝组织的比较

    虽然肝癌和正常肝组织缺血再灌注后SOD和NO均有改变，但经统计学分析，再灌注前、再灌注后各时点的癌组织SOD和NO浓度及其变化程度明显高于正常肝组织。肝癌组织中血管窦间隙不规则，HE染色见内皮细胞呈线状或散在分布。长条状内皮细胞具有核浓缩，染色质碎裂等特点为凋亡细胞。癌组织中凋亡细胞的数量明显多于正常肝组织，见表1、2。

    3  讨论

    缺血再灌注对正常肝组织和肝脏肿瘤组织均可造成损伤,其中氧自由基的改变和细胞凋亡是损伤的重要病理过程。缺血再灌注除直接损伤肿瘤细胞外，也可能影响肿瘤组织内血管并参与肿瘤细胞的损伤过程。研究发现，肿瘤组织内血管的增殖是一个受复杂因素相互作用和共同影响的结果［3］。肿瘤表1  肝癌组织、正常肝脏组织SOD和NO的改变注：与对照组比较，*P<0.05**P<0.01表2  HE染色肝脏血管窦内皮细胞的凋亡注：与对照组比较，*P<0.05**P<0.01,与正常肝组织比较，ΔP<0.05#P<0.01

    组织内血管的增殖对肿瘤组织的生长起了重要的作用。

    大量研究结果表明，缺血再灌注对正常组织具有明显的损伤作用，但也与肿瘤的发生发展有关，缺血再灌注过程中的氧自由基对肿瘤组织也可产生明显的细胞凋亡和损伤［4］。我们在研究中已发现，肝癌缺血再灌注后SOD和NO浓度均出现下降。因为SOD是氧自由基的清除剂，在清除氧自由基的过程中得以消耗而使其浓度下降。NO也可与增多的氧自由基反应使其浓度降低。SOD和NO的改变间接反映了氧自由基增多和损伤。氧自由基的改变除造成了肝细胞的损伤和凋亡外。也可能使肝血窦内皮细胞损伤和凋亡。实验结果表明，肝癌缺血再灌注后肝血窦内皮细胞出现了明显的凋亡且数量变化特点与SOD及NO相似，提示氧自由基的改变与肝血窦内皮细胞凋亡有明显的关系。因此根据肿瘤组织与血管增殖的关系分析，氧自由基的改变可能同时直接损伤肝细胞和肝血窦内皮细胞，但肝血窦内皮细胞的凋亡又进一步增强了肝细胞的损伤。在缺血再灌注过程中如能加强肝血窦内皮细胞的损伤将促进肝癌细胞的损伤，有利于对肝癌的治疗。但相关内容还需进一步深入研究。

 以往的研究结果显示，缺血再灌注对正常组织和肝癌组织损伤程度具有明显的差异，包括氧自由基浓度及肝细胞凋亡的数量等。有人发现，对肝肿瘤的热隔离加缺血再灌注可引起肿瘤坏死因子α（TNFalpha）水平的提高，并产生治疗作用[5]。在缺血再灌注的同时给予光动学疗法（Photodynamic therapy，PDT）,通过检测缺血再灌注中具有特异性氧化损伤作用的黄嘌呤氧化酶的改变，认为PDT是以炎性反应对肿瘤进行杀伤的，并观察到缺血再灌注2小时能杀死肿瘤细胞，明显缩小肿瘤的体积而对周围正常组织影响很小[6]。间断缺血再灌注或缺血再灌注过程中诱导的中性粒细胞弹性蛋白酶可减少结肠癌的肝脏转移[7,8]。但在这些过程中对正常组织的损伤较小。实验中我们也观察到与上述相似的结果，即肝癌组织缺血再灌注后肝血窦内皮细胞的凋亡明显强于正常肝组织，这对于利用缺血再灌注损伤治疗肝癌带来希望。

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