survivin反义核酸诱导HeLa细胞凋亡的实验

survivin反义核酸诱导HeLa细胞凋亡的实验作者：尹青,黄 浩    作者单位：1.430077 武汉, 华中科技大学附属梨园医院妇产科;2.武汉第一医院实验中心    【摘要】  目的 探讨survivin反义核酸诱导HeLa细胞发生凋亡的可能性,揭示该凋亡发生与Bcl2和Bax之间的关系。 方法 采用TUNEL染色法，研究survivin反义核酸与HeLa细胞凋亡的关系;通过免疫组织化学法检测凋亡相关基因Bcl2和Bax的表达。结果 survivin反义核酸在体外能诱导HeLa细胞凋亡,下调Bcl2的表达,增强Bax的表达。结论 诱导HeLa细胞凋亡是survivin反义核酸抗HeLa作用的机制之一,survivin反义核酸可能通过下调Bcl2的表达，增强Bax的表达，诱导HeLa细胞发生凋亡。    【关键词】  反义核酸; 宫颈癌; HeLa细胞; 凋亡    Apoptosis in HeLa Cells Induced by Antisense Oligodeoxynucleotide of  Human survivin Gene  YIN Qing 1,HUANG Hao2  1.Department of Obstetrics & Gynecology,Liyuan Hospital,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;2.Center of Experimental Medicine,Wuhan First HospitalAbstract：Objective   To investigate the apoptosis in HeLa cell induced by antisense oligodeoxynucleotide of human survivin gene,and the relation between this apoptosis and expression of Bcl2 and Bax.Methods  In vitro experiments,TUNEL staining method was used to detect the apoptosis status of cervical cancer HeLa cell line treated by antisense oligodeoxynucleotide of survivin.Immunohistochemical staining was used to detect the expression of apoptosisrelation gene Bcl2 and Bax.Results  Antisense oligodeoxy nucleotide of  survivin was able to induce the apoptosis in HeLa cells.Antisense oligodeoxynucleotide of survivin can reduce the expression of apoptosisrelation gene Bcl2 and increase the expression of apoptosisrelation gene Bax.Conclusion  Antisense oligodeoxynucleotide of survivin was able to induce the apoptosis in HeLa cell.This apoptosis may be mediated by downregulation of apoptosisregulated gene Bcl 2 and up regulation of Bax.    Key words：Antisense oligonucleotides;Cervical cancer;HeLa cell line;Apoptosis survivin     是近年来发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP) 家族的一个新成员,是抑制细胞凋亡的重要成分,在恶性肿瘤的发生发展中起着重要作用［1］。已有研究结果表明survivin 在HeLa细胞中呈高表达,且其表达程度与恶性程度和侵袭转移能力密切相关［2］。因此抑制survivin的表达可望成为治疗宫颈癌的有效手段。我们合成了针对人survivin基因的反义、正义核酸,通过TUNEL染色法,在体外定性、定量地研究survivin反义核酸与HeLa细胞凋亡的关系;同时通过免疫组织化学法检测凋亡相关基因Bcl2和Bax的表达,研究survivin反义核酸诱导HeLa细胞凋亡发生的可能机制。1  材料与方法    1.1  材料    HeLa细胞株，购自武汉大学生命科学院。细胞凋亡原位检测试剂盒、SABC试剂盒和Bcl2、Bax单抗,均为中山生物公司产品。survivin(反义):5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG 3′;survivin(正义):5′GTTCCTCGACCTTCCGACCC  3′,均经计算机网上检索与survivin基因以外的已知人类基因无同源性。由上海生物工程公司合成,全硫代修饰。    1.2  方法    1.2.1  细胞培养  HeLa细胞贴壁生长于含10%胎牛血清、青霉素100u/ml和链霉素100mg/ml的RMPI1640培养液中,置于37℃、5 % CO2饱和湿度培养箱中培养,每两天换一次液,当80%细胞融合时传代培养。所有实验均采用处于指数生长期的细胞。    1.2.2  survivin反义核酸诱导HeLa细胞凋亡(TUNEL染色法)置盖玻片于6孔细胞培养板内。取指数生长期的HeLa细胞(细胞数为105/ml)0.4ml铺于盖玻片上。37℃孵育,待细胞贴壁生长。各孔内另加含survivin反义核酸10μmol/L培养液3ml,与细胞共育,时间分别为24、36、48、72h。每个时间组均设PBS对照孔。弃去孔内培养液,10%甲醛固定。PBS缓冲液洗涤后,0.3%过氧化氢甲醇溶液及预冷的0.1% Triton  ×100处理细胞。DAB显色。染色后细胞核呈棕褐色的细胞被判为凋亡细胞。随机选取50个高倍镜视野(>1000个细胞),凋亡指数AI=凋亡细胞数÷总细胞数×100%。    1.2.3  免疫组织化学法检测Bcl2和Bax蛋白表达  细胞处理同上，将survivin反义核酸与细胞分别共育24、36、48、72h,弃去孔内培养液，10%甲醛固定。柠檬酸盐缓冲液洗涤后,微波处理10min。DAB显色。光镜下观察。Bcl2和Bax阳性反应为黄色到棕褐色,定位于胞浆亦可见于胞膜和核膜。    1.2.4  统计学方法  所有数据按Ridit分析法处理。2  结果    2.1  survivin反义核酸诱导HeLa细胞凋亡    光镜下检查可见,经survivin反义核酸(10μmol/ L)处理后,HeLa细胞凋亡数明显增加，见表1 。棕褐色染色颗粒定位于细胞核内。染色阳性的HeLa细胞出现细胞核碎裂,核质固缩,细胞膜突出形成质膜小泡等凋亡细胞形态学变化。表1  survivin反义核酸诱导HeLa细胞凋亡数    2.2  Bcl2和Bax蛋白表达    survivin正义核酸处理组的HeLa 细胞中,Bcl2蛋白产物染色呈++～+++ (其中3例标本为++,4例标本为+++),survivin反义核酸(10μmol/ L,24h)处理组中,Bcl2蛋白产物染色呈-～+(其中5例标本为-，2例标本为+)。经Ridit法检验,survivin反义核酸能使Bcl2蛋白产物表达显著减少(P<0.05)。survivin正义核酸处理组的HeLa细胞中,Bax蛋白产物染色呈-～+（其中5例标本为-,2例标本为+） ,survivin反义核酸(10μmol/L,24h)处理组中,Bax蛋白产物染色仍呈+～+++(其中3例标本为+,2例标本为++,2例标本为+++)。经配对Ridit法检验,survivin反义核酸使Bax蛋白产物表达增强(P<0.05)。3  讨论    survivin既能抑制细胞凋亡,又可调节有丝分裂。选择性表达于常见的多种恶性肿瘤,而在癌旁正常组织和成人分化组织中并不表达［34］。可作为一种潜在的药物靶向而引起关注。    我们合成survivin的反义、正义核酸,研究其诱导HeLa细胞凋亡的功能。结果证实survivin反义核酸对HeLa细胞具有诱导凋亡作用，并且发现HaLa细胞凋亡数随着时间的延长而明显增加,进一步证实survivin反义核酸通过诱导细胞凋亡而达到杀伤HeLa细胞的作用。    Bcl2家族是公认的凋亡抑制基因,可抑制多种因素，如氧自由基和p53诱导的细胞凋亡［57］。本研究表明,未经处理的HeLa细胞Bcl2大量表达,而经survivin反义核酸处理后,Bcl2蛋白的表达明显下调;Bax是Bcl2的同源体。HeLa细胞中发现Bax的表达缺失,而经survivin反义核酸处理后,Bax基因表达增强，使Bcl2/Bax比值减少,这可能是survivin反义核酸诱导HeLa细胞凋亡的分子机制之一。【参考文献】［1］ Bourhis E,Hymowitz SG,Cochran AG.The mitotic regulator survivin binds as a monomer to its functional interactor borealin［J］.J Biol Chem,2007，282(48):3501835023.［2］ Nakahara T,Takeuchi M,Kinoyama I,et al.YM155,a novel smallmolecule survivin suppressant,induces regression of established human hormonerefractory prostate tumor xenografts［J］.Cancer Res,2007,67(17):80148021.［3］Li B,Fan J,Liu X,et al.Suppression of colorectal tumor growth by regulated survivin targeting［J］.J Mol Med,2006,84(12):10771086.［4］ Vaira V,Lee CW,Goel HL,et al.Regulation of survivin expression by IGF1/mTOR signaling［J］.Oncogene,2007,26(19):26782684.［5］ Li ZB,Wang JY,Jiang B,et al. 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