RhoC过表达对人脐静脉内皮细胞体外迁移及血管生成能力的影响
发表时间：2010-02-23 浏览次数：422次
RhoC过表达对人脐静脉内皮细胞体外迁移及血管生成能力的影响作者：赵良平1，张庆华，王薇娜 ，田 训 ，梁逢奇 ，黄 磊 ，熊国平，马 丁 作者单位：1.430014 武汉市中心医院妇产科；2.武汉大学中南医院心内科；3.华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科 【摘要】 目的 探讨RhoC基因过量表达对内皮细胞体外迁移及血管生成过程的影响。方法 构建RhoC真核表达载体，以脂质体转染人脐静脉内皮细胞(HUVE)，采用RTPCR和Western blot检测RhoC的mRNA及蛋白表达水平; 划痕实验检测细胞迁移能力; 胶原基质胶三维培养检测内皮细胞体外血管生成能力。结果 转染RhoC实验组与空载体对照组比较，RhoC mRNA和蛋白表达明显增高；细胞迁移能力和血管样结构生成能力明显增强。结论 RhoC高表达能促进人脐静脉内皮细胞体外迁移及血管生成。 【关键词】 RhoC; 人脐静脉内皮细胞; 细胞迁移; 血管形成 Overexpression of RhoC Affects Human Umbilical Vein Endothelial Cell Migration and Angiogenesis in Vitro ZHAO Liangping1， ZHANG Qinghua1，WANG Weina2， TIAN Xun1， LIANG Fengqi1， HUANG Lei1， XIONG Guoping1，MA Ding3 1.Department of Gynecology & Obsterics， The Central Hospital of Wuhan， Wuhan 430014， China; 2.Department of Cardiology，Zhongnan Hospital， Wuhan University; 3.Department of Gynecology & Obsterics， Tongji Hospital， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and TechnologyAbstract：Objective To investigate the effects of RhoC overexpression on human umbilical vein endothelial(HUVE) cell migration and angiogenesis in vitro.Methods Transfecting RhoC gene into HUVE cells by Lipofectamine2000.The expression of RhoC mRNA and protein were detected respectively by RTPCR and Western blot， respectively.Wound assay in vitro and threedimensional culture were used to detect the migration and angiogenesis capacity of HUVE.Results RhoC expression was increased by transfecting RhoC gene into HUVE， meanwhile， the cells migration and angiogenesis capacity were enhanced.Conclusion RhoC may increase the capacity of HUVE migration and angiogenesis in vitro. Key words：RhoC; Human umbilical vein endothelial cells (HUVE); Migration; Angiogenesis RhoC 是小G球蛋白超家族Rho家族的成员（RhoGTPases）作为细胞迁移启动调节的关键分子，参与细胞头部伪足的延伸、新的粘附建立及细胞体尾部收缩等过程，对肿瘤的恶性转型、增生、侵袭转移等过程均发挥作用 [13]，且对血管形成有较强的影响。本研究通过RhoC转染人脐静脉内皮细胞，检测细胞RhoC的表达、体外迁移能力及血管样组织生成，从而探讨RhoC在内皮细胞迁移及血管生成过程中的作用。1 材料与方法 1.1 主要材料 胎牛血清、DMEM、TRIZOL试剂（Gibco公司），人脐静脉内皮细胞系HUVE（武汉大学典型培养物保藏中心），RTPCR检测试剂盒(TaKaRaBiotechnology公司)， PCR产物回收试剂盒、Ⅰ型胶原蛋白（Sigma公司），载体质粒为PEGFC1（Clontech公司）， BamHⅠ、EcoRⅠ、T4连接酶、RhoC抗体和βactin抗体（Santa Cruz公司），胶回收试剂盒（上海华瞬生物公司）。 1.2 细胞培养 人脐静脉内皮细系HUVE（武汉大学典型培养物保藏中心），用含10%胎牛血清（Gibco公司）的DMEM培养液（Gibco公司），37℃、5% CO2培养。 1.3 pEGFPC1RhoC质粒的构建 根据Genebank上登录的RhoC全长cDNA序列，利用Primer preimier软件设计RhoC引物:For: 5′CGGAATTCTCCTCATCGTCTTCAGCAAG3′内含BamHⅠ酶切位点;Rev: 5′CGGGATCCCATAAGGGCTGTGCTTGCAG3′；内含EcoRⅠ酶切位点; 以细胞总RNA为模板，PCR扩增RhoC基因片断，并将其插入到pEGFPC1真核表达载体CMV启动子的下游， 构建pEGFPC1RhoC表达质粒，该质粒携带有新霉素基因(NEO基因)，转化大肠杆菌DH5α， 常规扩增后挑选阳性单克隆进行酶切鉴定和测序。上述引物合成和核酸序列分析均由大连宝生物有限公司完成。 1.4 脂质体（Lipofect2000，LF）介导的转染 按LF说明书在6孔板中进行转染。预先将HUVE接种于6孔板，2×105 / 孔，待细胞融合50%～80%时分别转染重组体pEGFPC1RhoC（实验组）和空载体pEGFPC1（对照组），4h后加10％血清终止。12h后进行三维培养，24h后进行划痕实验。72h荧光显微镜下观察转染效率约30%，收集细胞提取总RNA 和蛋白质，采用RTPCR和Western blot法检测实验组和对照组RhoC基因的表达水平。以RhoC与GAPDH比值表示RhoC mRNA的相对表达水平；以RhoC与βactin比值表示RhoC蛋白质的相对表达水平。实验重复3次。 1.5 逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测RhoCmRNA水平 TRIZOL试剂（Gibco公司）一步法提取总RNA、紫外分光光度计测纯度与浓度。取2μg总RNA，用AMV逆转录酶进行反转录，PCR扩增RhoC，同时扩增GAPDH作为内参照，引物由上海生物工程公司合成。RhoC引物序列为：5′CGGAATTCTCCTCATCGTCTTCAGCAAG3′下游引物：5′CGGGATCCCATAAGGGCTGTGCTTGCAG3′；内参基因GAPDH引物序列为：上游引物：5′ACGGATTTGGTCGTATTGGG3′；下游引物：5′TGATTTTGGAGGGATCTCGC3′。PCR反应条件为：94℃ 60s，94℃ 30s， 59℃ 60s， 72℃ 90s， 28个循环，再72℃延伸10min。RhoC扩增片段为590bp， GAPDH为230bp。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统摄像，软件Gel works ID advanced V4d分析各条带强度，基因表达值为各种细胞mRNA吸光值/内参吸光值。 1.6 Western blot 分析 收集细胞，以三去污剂50μl、100μg/ml PMSF和1μg/ml Aprotinin各1μl裂解细胞，4℃ 12000r/min×15min离心，取上清采用Bradford法进行蛋白质定量。取50μg蛋白上样，经10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至硝酸纤维素膜， 5％脱脂奶37℃封闭1h，分别加1∶1000稀释的RhoC抗体和βactin抗体(Santa Cruz公司)4℃过夜，碱性磷酸酶标记的二抗进行蛋白杂交。图像经Uvp grabit Image软件采集，Gel works ID advanced V4d软件测定条带的吸光度值，取其与βactin的比值为相对吸光度值。 1.7 划痕实验 转染24h后，实验组和对照组细胞均贴壁融合，以同一20μl的Tip头划痕，倒置显微镜下观察测量，培养24h后再次观察测量。重复实验共3组。 1.8 三维培养体外血管生成试验 以Ⅰ型胶原蛋白（Sigma）配制胶原基质[45]。2mg/ml Ⅰ型胶原24倍体积、10×EBSS 3倍体积、0.1 mmol NaOH 3倍体积、DMEM 30倍体积、FBS 20倍体积均在4℃混合，六孔板每孔加2ml混合培养液及转染12小时后的细胞1×104个，5天后在倒置显微镜下观察比较实验组和对照组的细胞排列及结构。重复实验3次。 1.9 统计学方法 实验数据均以均数±标准差表示，采用SPSS 11.0软件进行t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。2 结果 2.1 人脐静脉内皮细胞RhoC的表达 在mRNA水平，实验组和对照组RhoC的表达丰度（RhoC /GAPDH）分别为(12.01±1.72)和(6.81±1.24)，两组差异具有统计学意义(P<0.05，n=3)，见图1 。在蛋白质水平，实验组和对照组RhoC的表达丰度（RhoC/βactin）分别为(4.81±0.56)和(3.02±0.32)，两者差异亦具有统计学意义（P<0.05，n=3），见图2。 2.2 RhoC对人脐静脉内皮细胞迁移能力的影响 细胞对损伤的反应性增生在24h内不会开始， 因此，24h内汇合静止的单层细胞受伤只能靠细胞移动来愈合。划痕愈合实验反应细胞迁移能力[5]。比较划痕后0h的宽度与24h的宽度差，0h的宽度，实验组与对照组相同，而24h的宽度，实验组较对照组明显变窄，愈合百分比分别为（65±6.4）%和（54±5.5）% （P<0.05，n=3），表明转染RhoC后，细胞迁移能力明显增强，见图3。 2.3 RhoC 对人脐静脉内皮细胞体外形成类血管结构能力的影响 转染12h后的细胞于三维培养基中培养，5天后在倒置显微镜下观察，实验组与对照组各随机取6个高倍镜视野对血管样结构计数，实验组为（5.01±1.48），对照组为（1.72±1.05），两者差异有统计学意义（P<0.05，n=6），见图4。3 讨论 血管形成在许多生理、病理过程中（如炎症、创伤愈合、肿瘤生长和转移等）起重要作用。无论是原发肿瘤还是继发肿瘤在生长和扩散过程中都依赖血管生成[6]。进一步弄清血管形成的机理以应用血管生成抑制剂阻断肿瘤转移成为肿瘤研究领域的重要热点。血管形成过程包括基质降解、内皮移行、内皮增殖、分支形成及管腔化等过程[7]。这一过程受许多因素影响，包括细胞外基质、生长因子、膜嵌合蛋白、整合素等。这些分子产生的信号导致细胞骨架的改变，从而引起细胞迁移、增生、出芽、管腔化，最终形成新血管[8]。其中肌动蛋白和细胞微管骨架可调节内皮细胞的增生，维持和改变内皮细胞的形态，增加其运动活性，在血管形成过程中起重要作用[9]。 RhoC存在三磷酸鸟苷（GTP）结合的活性态和二磷酸尿苷（GDP）结合的非活性态两种形式，两者之间转换使他们能够发挥一种类似“分子开关（molecular switch）”的作用。RhoC最重要的功能是调节肌动蛋白细胞骨架，肌动蛋白细胞骨架不仅在细胞形状改变、细胞运动和吞噬作用中起重要作用，还在细胞的各种生命活动如增殖、生长和凋亡中起关键作用。在真核细胞中，RhoC控制肌动蛋白细胞骨架的重组。其中，RhoC可以使肌动蛋白聚集张力纤维(stressfiber)以维持细胞的形态并赋予细胞韧性和强度;RhoC可以使整合素以及相关蛋白质如纤维连接蛋白(FN)聚集成黏连复合物[10];RhoC与细胞骨架相关蛋白如黏着斑激酶(FAK)、桩蛋白(paxillin)、肌球蛋白轻链(MLC)和内收蛋白(ad2ducin)的磷酸化直接相关且参与调节细胞运动和迁移。RhoC还能明显上调MMPs的表达水平，同时能增强MMPs的活性，使其降解细胞外基质能力增强，从而促进细胞迁移[11]。许多研究表明，RhoC促进肿瘤的侵袭转移。本研究发现，上调RhoC表达水平后内皮细胞体外迁移能力和形成血管样组织能力明显增强。这表明RhoC可能在内皮细胞的迁移、血管形成过程中起重要作用。促进血管生成可能是RhoC促进肿瘤转移的机制之一。 血管形成包括一系列复杂过程，进一步研究明确血管形成的机制将有助于找到有效的治疗靶点，以此通过抗血管生成从而达到抗肿瘤转移及其他血管增生疾病的目的。【参考文献】［1］ Park HJ， Kong D， IruelaArispe L， et 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