潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞CNE1中端粒酶的激活作用及相关调控机制

潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞CNE1中端粒酶的激活作用及相关调控机制作者：赵同伟,陈小毅,罗伟仁,赵颖海    作者单位：524023 广东湛江,广东医学院病理学教研室    【摘要】  目的 探讨LMP1对鼻咽癌上皮样细胞系CNE1（nasopharyngeal carcinoma epithelioid cell lines ，CNE )中端粒酶活性的影响及相关调控机制。方法 分别采用SP法、RTPCR法和PCRELISA法检测鼻咽癌细胞CNE1、CNE1GL（转染了目的基因质粒PATGFPLMP1的CNE1细胞株）和CNE2Z中LMP1、NFκB、cmyc和hTERT的表达、hTERT mRNA水平和端粒酶活性。结果 （1）CNE1GL与CNE1细胞相比，LMP1、NFκB、cmyc、hTERT的表达水平均高于CNE1细胞中各指标的表达，差异有统计学意义（P<0.01）。CNE2Z和CNE1GL、CNE1相比，细胞中各指标的表达水平均最高 (P<0.01或P<0.05)。CNE1GL细胞中，LMP1与NFκB、NFκB与cmyc及LMP1与cmyc的表达之间均呈显著正相关（P<0.01或P<0.05）。（2）hTERT mRNA水平在CNE1GL细胞明显高于CNE1细胞，差异有统计学意义（P<0.01）；在三种细胞中，CNE2Z细胞 中hTERT mRNA水平最高（P<0.01）。（3）CNE1GL细胞中的端粒酶活性明显高于CNE1细胞，差异有统计学意义（P<0.05）；CNE1GL细胞中的端粒酶活性略低于CNE2Z细胞（P>0.05）；CNE2Z细胞中的端粒酶活性明显高于CNE1细胞（P<0.01）。结论 在CNE1GL细胞中，LMP1通过激活hTERT转录而激活端粒酶。此调控过程可能和NFκB激活，NFκB进而上调 cmyc表达水平，cmyc提高hTERT转录水平有关。LMP1激活端粒酶可能是鼻咽癌癌变过程中的重要事件。    【关键词】  鼻咽肿瘤；潜伏膜蛋白1；激活；端粒酶逆转录酶；端粒酶    Activation of LMP1 to Telomerase in  Human Nasopharyngeal Cell Line，CNE1 and Related Regulation Mechanisms  ZHAO Tongwei,CHEN Xiaoyi,LUO Weiren,ZHAO Yinghai Department of Pathology,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023,China    Corresponding Author:CHEN Xiaoyi,Email:xychen@gdmc.edu.cnAbstract：Objective   To explore the influence to telomerase activity and related regulation mechanisms of LMP1 in a NPC cell line,CNE1.Methods  The expressions of LMP1,NFκB,cmyc and hTERT,the level of hTERT mRNA and the telomerase activity were respectively detected by SP,RTPCR and PCRELISA methods in NPC cell line CNE1,CNE1GL(CNE1 transfected with an eukaryotic plasmid,PATGFPLMP1) and CNE2Z.Results  (1)The expressions of LMP1,NFκB,cmyc and hTERT in CNE1GL is higher than those in CNE1 (P<0.01).Among three types of cells,the expressions of LMP1,NFκB and cmyc and hTERT in CNE2Z was highest (P<0.01 or P<0.05).Pearson correlation analysis showed that the expressions between LMP1 and NFκB,NFκB and cmyc,LMP1 and cmyc in CNE1GL were significantly correlated （P<0.01 or P<0.05）.(2) The hTERT mRNA level in CNE1GL was higher than that in CNE1,the difference was statistial significant（P<0.01）; the hTERT mRNA level in CNE2Z was highest in three types of cells（P<0.01）.(3) The telomerase activity in CNE1GL was higher than that in CNE1,the difference was statistical significant（P<0.05）; the telomerase activity in CNE1GL was a little lower than that in CNE2Z（P>0.05）; the telomerase activity in CNE2Z was higher than that in CNE1（P<0.01）.Conclusion  LMP1 activates telomerase by activating hTERT transcription.This process is possibly related to NFκB activation by LMP1,upregulating the expression of cmyc by NFκB  and improving transcription level of hTERT by cmyc in CNE1GL.Telomerase activation by LMP1 may be an important occurrence in the stage of tumorigeness of NPC.    Key words：Nasopharyngeal neoplasms; Latent membrane protein 1; Activation; Human telomerase reverse transcriptase;  Telomerase    鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)发病和EB病毒（EpsteinBarr Virus,EBV）潜伏感染密切相关。潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1,LMP1）是EBV编码的一种较为明确的病毒癌基因，可通过激活NFκB等信号转导通路，调控相关基因表达，参与肿瘤的发生发展。此外在鼻咽癌中hTERT mRNA和端粒酶阳性率为90%左右，两者呈明显正相关[1]，说明NPC癌变过程中存在端粒酶的激活。目前，对NPC中端粒酶的激活机制研究较少，为此本课题利用成功转染了LMP1质粒的CNE1GL细胞，检测LMP1表达、hTERT mRNA水平、端粒酶活性及端粒酶调控相关蛋白NFκB、cmyc、hTERT的表达，从LMP1入手，探讨LMP1与端粒酶激活的关系及其端粒酶激活的可能途径。1  材料和方法    1．1  材料    1.1.1  细胞  CNE1细胞系（鼻咽分化好的角化性鳞状细胞癌细胞系，LMP1失表达）、CNE1GL细胞系（成功转染了目的基因质粒PAT GFP  LMP1的CNE1细胞株）和CNE2Z细胞系（鼻咽分化型非角化性癌细胞系，LMP1表达）均为广东医学院病理教研室保存。    1.1.2  主要试剂  LMP1抗体购自DAKO公司，hTERT兔抗人多克隆抗体、cmyc 鼠抗人单克隆抗体、NFκB p65单抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，TRIzol试剂为Invitrogen公司产品。    1.1.3  主要试剂盒  一步法RTPCR试剂盒为QIAGEN产品，TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA试剂盒为罗氏公司产品，免疫组化染色试剂盒HistostainTMPlus Kits、浓缩型DAB试剂盒为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。    1.1.4  引物序列设计和合成  扩增hTERT的引物5′CGGAA GAGTGTCTGGAGCAA3′ (上游); 5′GGATGAAGCGGAGTCTGGA3′(下游)［2］；扩增GAPDH的引物5′GGAAGCTTGTCATCAATGG3′(上游)，5′CTG TGGTCATGAGTCCTTC3′(下游)［3］。以上引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。    1.1.5  主要仪器  Mastercycler 梯度PCR仪。    1．2  方法    1.2.1  免疫细胞化学  收集CNE1、CNE1GL、CNE2Z细胞各约4×106置于EP管中，常规固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋及连续切片；采用SP法。同一蜡块连续切片4张，为1个样本，分别记为LMP1、NFκB、cmyc和hTERT。采用PBS代替一抗作空白对照，细胞胞浆中出现棕黄色沉淀颗粒为阳性细胞。采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统的免疫组化自动分析程序检测各样本阳性细胞的阳性目标积分光密度值来反映各蛋白的相对表达量。    1.2.2  RTPCR检测  hTERT mRNA水平按照TRIzol Reagent说明书抽提CNE1、CNE1GL、CNE2Z三种细胞中的总RNA，而后按照试剂盒说明书加入各相应试剂，各取2μg总RNA加入混和物中，按照设定PCR程序进行PCR反应：逆转录反应，50℃，30min；PCR激活反应，95℃，15min；循环过程：94℃，45s；56℃，45s；72℃，60s；共35循环；最后72℃，10min，4℃维持。将PCR产物上样于0.8%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪下拍照。采用图像分析软件Labwork分析电泳条带的光密度值，并与内参照GAPDH的相对光密度值比较，实验重复3次，结果求出平均值并获得hTERT mRNA的相对表达量。    1.2.3  PCRELISA法检测端粒酶活性  三组细胞各取约2 × 105个细胞作为一个样本，分别从不同的培养瓶收集细胞，各取三个样本；按照说明书进行细胞抽提，将25μl 反应混合物和1μl 细胞抽提物分别加入EP管，加入灭菌三蒸水至总体积到50μl进行端粒重复序列扩增（TRAP反应）反应，而后按说明进行杂交反应（ELISA），最后向每孔中加入100μl终止液终止颜色反应，颜色反应由蓝色变为黄色；加入终止液后30min内，用酶标仪检测相对空白参照反应液450nm处吸光度（A450nm），测得的A450nm即为该细胞的相对端粒酶活性。    1.2.4  统计学方法  实验数据以±s表示，数据资料采用SPSS11.0统计软件做独立样本t检验和Pearson相关分析。2  结果    2.1  免疫细胞化学结果     实验显示，CNE1GL细胞中LMP1、NFκB、cmyc、hTERT的表达水平均高于CNE1细胞中各指标的表达，见表1，图1～4，差异有统计学意义（P<0.01）。在CNE2Z细胞中，LMP1、NFκB、cmyc、hTERT的表达水平均高于各指标在CNE1GL和CNE1细胞中的表达 (P<0.01或P<0.05)。    Pearson相关分析看出，CNE1GL细胞中，LMP1与NFκB、NFκB与cmyc及LMP1与cmyc的表达之间均呈显著正相关（r=0.998，P<0.01;r=0.955，P<0.05;r=0.971,P<0.05）。 表1  LMP1、NFκB、cmyc和hTERT在CNE1细胞中的表达*CNE1中LMP1阴性表达CNE1和CNE2Z细胞中各蛋白的表达之间均无显著相关性（P>0.05）。    2.2  RTPCR结果    各组细胞均有hTERT mRNA的表达，其RTPCR产物在凝胶上显示为145bp的电泳带，而GAPDH的RTPCR产物在凝胶上显示为339bp的电泳带，见图5。hTERT mRNA相对表达量见表2。表2  各组细胞hTERT mRNA 的相对表达量 结果显示，hTERT mRNA在CNE1GL细胞表达水平明显高于CNE1细胞，差异有统计学意义（t=5.845,P<0.01）；在CNE1GL细胞中hTERT mRNA表达水平明显低于CNE2Z细胞系（t=18.021,P<0.01）；hTERT mRNA在CNE1细胞中表达水平明显低于CNE2Z细胞（t=22.270,P<0.01）。    2.3  端粒酶活性检测结果    结果表明，3种细胞端粒酶活性均为阳性。CNE1GL细胞的端粒酶活性明显高于CNE1细胞，差异有统计学意义（t=3.246,P<0.05）；CNE1GL细胞中端粒酶活性略低于CNE2Z细胞，但差异无统计学意义（t=0.619,P>0.05）；CNE2Z细胞的端粒酶活性明显高于CNE1细胞（P<0.01），见表3。表3  CNE1、CNE2Z、CNE1GL三组细胞中端粒酶活性3  讨论      EB病毒是一种普遍存在的人类γ疱疹病毒，90％以上的人群在儿时即被感染，EB病毒在体内能感染B淋巴细胞即及上皮细胞并潜伏下来，产生一系列潜伏蛋白，是一种DNA致瘤病毒。在EB病毒感染的细胞中，至今已发现了11种潜伏蛋白的表达，其中有6种核蛋白EBNA1,EBNA2,EBNA3A,EBNA3B,EBNA3C及EBNALP，3种膜蛋白LMP1,LMP2A,LMP2B和两种小RNAs（EBERS）: EBERS1,EBERS2。目前公认LMP1在EBV致瘤机制中发挥重要作用，是一种致瘤癌基因。此外约90%的恶性肿瘤组织都存在端粒酶活性，而大多数良性肿瘤和正常组织细胞则缺乏端粒酶活性。众多研究［49］认为正常细胞在永生化的过程中端粒酶活性逐渐表现，端粒酶激活可能与恶性肿瘤之间关系密切。    hTERT的基因位于5p，在多种肿瘤中其表达水平和端粒酶的活性呈正比[1011]。研究发现，hTERT转录激活是端粒酶激活的关键环节，hTERT被认为是端粒酶的催化亚基。hTERT基因启动区含2个E盒及5个GC盒等多种转录因子结合位点[12]。其中E盒可以和cmyc、Mad1、USF1/2等转录因子结合，转录因子Sp1和Sp3可以和GC盒结合，多种转录因子均可对hTERT转录产生调控作用。    由于HPV与EBV同为DNA致瘤病毒，它们的LMP1和E6/7蛋白作用机制有很多相似性，因此存在LMP1激活NFκB通路导致cmyc表达增加，进而促进hTERT的转录，而激活端粒酶的可能性。研究发现，HPV E6可通过激活hTERT转录而激活端粒酶。Veldman等[13]研究发现，转染了HPV E6基因的角化上皮中，出现hTERTmRNA表达，端粒酶激活。LMP1在体内 NPC发展和体外鼻咽上皮永生化中发挥重要作用。研究发现，采用RNA干扰或反义hTERT寡聚核苷酸处理后，鼻咽癌细胞hTERT mRNA水平下降，端粒酶活性下降，说明hTERT转录参与了鼻咽癌端粒酶的激活过程[1415]。本实验结果显示：CNE1GL细胞中LMP1表达、hTERT mRNA水平和端粒酶活性均高于CNE1细胞，表明成功转染LMP1的CNE1GL细胞其hTERT mRNA的转录水平提高，端粒酶的活性增强，LMP1有可能是通过激活hTERT转录而激活端粒酶。    cmyc基因是一种高度保守的原癌基因，具有转录因子活性，和细胞凋亡及端粒酶激活等关系密切。最近研究表明，HPV E6可通过cmyc而激活hTERT转录，进而激活端粒酶[16]。Oh等[17]研究表明在转染了HPV E6而导致细胞永生化的细胞中，HPV E6对hTERT转录的诱导受hTERT启动子近端的258个碱基的调控，其区域内的cmyc结合位点突变一定程度上降低了hTERT启动子的活性，Sp1结合位点的突变也降低了hTERT启动子的活性，如两者均突变则所有HPV E6对hTERT转录的激活作用消失，提示HPV E6对hTERT转录激活作用依赖转录因子cmyc和Sp1对hTERT启动子的激活作用。本实验结果显示在CNE1GL细胞中，LMP1和cmyc表达水平呈显著正相关，而且cmyc与 hTERT表达水平均高于CNE1细胞，结果提示CNE1细胞成功转染LMP1质粒后，cmyc表达增高和hTERT转录水平提高，其作用机制可能和cmyc表达提高、进一步激活hTERT启动子有关；至于和Sp1是否有关，值得进一步研究。    在cmyc基因启动区存在两个功能性的NFκB结合位点，NFκB作为正性调控因子激活后可上调cmyc表达[18]。Duyao等[19]发现在T细胞系Jurkat 和HeLa中，同时转染启动子含有NFκB两结合区域的cmycCAT杂和基因质粒和Tax质粒，可见cmycCAT的表达，而当两结合区域突变或其一突变时可见cmycCAT表达明显下降。在Jurkat 和HeLa细胞中，HTLV1 Tax可通过激活NFκB来诱导cmyc的表达。SinhaDatta U等[20]将HTLV1 Tax质粒转染到原始T细胞中，瞬时转染法显示Tax通过NFκB途径激活了hTERT启动子；染色质免疫沉淀印迹法进一步显示，NFκB调控的hTERT启动子激活和hTERT启动子上结合增加的cmyc、 Sp1有关，提示HTLV1 Tax可能通过激活NFκB通路进而增加和hTERT启动子上结合的转录因子cmyc、 Sp1而激活hTERT转录。在EBV相关肿瘤中，LMP1可通过经典和非经典等多种方式激活NFκB[2122]。本实验结果显示，在CNE1GL中，LMP1与NFκB、NFκB与cmyc表达呈显著正相关，提示在 NPC细胞中LMP1表达激活NFκB后，NFκB可能进而上调cmyc的表达水平，cmyc表达上调后和hTERT启动子cmyc结合位点结合增加，hTERT转录活性增强，hTERT转录水平提高。    综上所述，在CNE1GL中可能存在如下LMP1激活端粒酶的机制：LMP1表达激活转录因子NFκB，NFκB激活后上调了其靶基因cmyc的表达，cmyc表达上调后和hTERT启动子cmyc结合位点结合增加，hTERT转录活性增强，hTERT mRNA水平提高，端粒酶活性提高，激活端粒酶。上述LMP1激活端粒酶的机制在 NPC癌变过程中可能起重要作用，当然此通路还需要进一步的研究来证实和完善。【参考文献】［1］ Cheng RY,Yuen PW,Nicholls JM,et al.Telomerase activation in nasopharyngeal carcinomas［J］.Br J Cancer,1998,77(3):456460.［2］ Nakamura TM,Morin GB,Chapman KB,et al.Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human［J］.Science,1997,277(5328):955959.［3］ Zou SQ,Qu ZL,Li ZF,et al.Hepatitis B virus X gene induces human telomerase reverse transcriptase mRNA expression in cultured normal human cholangiocytes［J］.World J Gastroenterol,2004 ,10(15):22592262.［4］ Cheng RY，Yuen PW,Nicholls JM,et al.Telomerase activation in nasopharyngeal carcinomas［J］.Br J Cancer,1998,77(3):456460.［5］ Yasui W,Yokozaki H,Fujimoto J,et al.Genetic and epigenetic alterations in multistep carcinogenesis of the stomach［J］.J Gastroenterol,2000,35(12):111115.［6］ Halvorsen TL,Leibowitz G,Levine F.Telomerase activity is sufficient to allow transformed cells to escape from crisis［J］.Mol Cell Biol,1999,19(3):18641870.［7］ Kyo S,Takakura M,Taira T,et al.Sp1 cooperates with cmyc to activate transcription of the human telomerase reverse transcriptase gene (hTERT)［J］.Nucleic Acids Res,2000,28(3):669677.［8］ Farwell DG,Shera KA,Koop JI,et al.Genetic and epigenetic changes in human epithelial cells immortalized by telomerase［J］.Am J Pathol,2000,156(5):15371547.［9］ Sun W,Kang KS,Morita I,et al.High susceptibility of a human breast epithelial cell type with stem cell characteristics to telomerase activation and immortalization［J］.Cancer Res,1999,59(24):61186123.［10］Ohuchida K,Mizumoto K,Ogura Y,et al.Quantitative assessment of telomerase activity and human telomerase reverse transcriptase messenger RNA levels in pancreatic juice samples for the diagnosis of pancreatic cancer［J］.Clin Cancer Res,2005,11(6):22852292.［11］Yu HP,Xu SQ,Lu WH,et al.Telomerase activity and expression of telomerase genes in squamous dysplasia and squamous cell carcinoma of the esophagus［J］.J Surg Oncol,2004,86(2):99104.［12］Tzukerman M,Shachaf C,Ravel Y,et al.Identification of a novel transcription factor binding element involved in the regulation by differentiation of the human telomerase (hTERT) promoter［J］.Mol Biol Cell,2000 ,11(12):43814391.［13］Veldman T,Liu X,Yuan H,et al.Human papillomavirus E6 and myc proteins associate in vivo and bind to and cooperatively activate the telomerase reverse transcriptase promoter［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(14):82118216.［14］Wang X,Xiao J,Zhao S,et al.Expression of telomerase subunits and its relationship with telomerase activity in nasopharyngeal carcinoma［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2001,81(9):553556.［15］Peng H,Wang X,Yang G,et al.The study on the role of telomerase activity in human nasopharyngeal carcinoma［J］.Zhonghua Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi,2000 ,35(4):289291.［16］McMurray HR,McCance DJ.Human papillomavirus type 16 E6 activates TERT gene transcription through induction of cmyc and release of USFmediated repression［J］.J Virol,2003,77(18):98529861.［17］Oh ST,Kyo S,Laimins LA.Telomerase activation by human papillomavirus type 16 E6 protein: induction of human telomerase reverse transcriptase expression through myc and GCrich Sp1 binding sites［J］.J Virol,2001,75(12):55595566.［18］La Rosa FA,Pierce JW,Sonenshein GE.Differential regulation of the cmyc oncogene promoter by the NFkappa B rel family of transcription factors［J］.Mol Cell Biol,1994,14(2):10391044.［19］Duyao P,Kessler DJ,Spicer DB,et al.Transactivation of the cmyc promoter by human T cell leukemia virus type 1 tax is mediated by NF kappa B［J］.J Biol Chem,1992,267(23): 1628816291.［20］SinhaDatta U,Horikawa I,Michishita E ,et al.Transcriptional activation of hTERT through the NF{kappa}B pathway in HTLVItransformed cells［J］.Blood,2004 ,104(8):25232531.［21］Luftig M,Yasui T,Soni V,et al.EpsteinBarr virus latent infection membrane protein 1 TRAFbinding site induces NIK/IKK alphadependent noncanonical NFkappaB activation［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(1):141146.［22］Eliopoulos AG,Caamano JH,Flavell J,et al.EpsteinBarr virusencoded latent infection membrane protein 1 regulates the processing of p100 NFkappaB2 to p52 via an IKKgamma/NEMOindependent signalling pathway［J］.Oncogene,2003,22(48):75577569.