抑制PI3K/Akt通路提高肺腺癌细胞化疗的效果
发表时间：2010-02-25 浏览次数：428次
抑制PI3K/Akt通路提高肺腺癌细胞化疗的效果作者：吴秋歌， 王 静，张茂林，苗丽君 作者单位：1. 450052 郑州大学第一附属医院老年病科，2.呼吸内科；3.郑州大学化学教研室 【摘要】 目的 探讨PI3K/Akt 信号转导通路抑制剂LY294002对肺腺癌细胞株A549及裸鼠移植瘤化疗的增敏作用。方法 采用MTT法及流式细胞仪检测LY294002、紫杉醇、LY294002联合紫杉醇对A549细胞增殖及凋亡的影响；通过裸鼠移植瘤模型检测LY294002、紫杉醇、LY294002联合紫杉醇对A549细胞成瘤性的影响。 结果 LY294002可增强紫杉醇对A549细胞的抑制作用，并且可提高其凋亡率。裸鼠移植瘤实验显示，LY294002与紫杉醇均可抑制移植瘤的生长，联用后抑瘤率增加。 结论 LY294002可增强紫杉醇对A549细胞、裸鼠移植瘤的化疗的敏感性，抑制PI3K/Akt信号转导通路可提高肺腺癌化疗的效果。 【关键词】 肺肿瘤；凋亡；LY294002；紫杉醇 Improving Chemotherapeutic Effect of Lung Adenocarcinoma by Inhibiting PI3K/Akt Signal Pathway WU Qiuge1, WANG Jing2, ZHANG Maolin3, MIAO Lijun2 1.Department of Gerontology,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China, 2.Department of Respiratory; 3. Department of Chemistry, Zhengzhou UniversityAbstract：Objective To explore the effects of specific inhibitor LY294002 of the PI3K/Akt signaling pathway in enhancing sensitivity to chemotherapeutic agent of lung adenocarcinoma cell line A549 and implanted tumor of nude mice. Methods The effects of LY294002、paclitaxel liposome、LY294002 combined with paclitaxel liposome on proliferation and apoptosis of human lung cancer cell line A549 were evaluated by MTT reduction assay and flow cytometry respectively; and the effects of that on neoplasia were verified by modeling subcutaneous implanted tumor of nude mice. Results LY294002 could increase the inhibitory effect of the paclitaxel liposome and increase the apoptosis ratio on cell line A549 in vitro. LY294002 and paclitaxel liposome could inhibit the growth of subcutaneous implanted tumor of nude mice and the inhibitory rate of LY294002 combined with paclitaxel liposome was higher significantly than that of LY294002 and paclitaxel liposome alone (P<0.01). Conclusion The LY294002 can enhance sensitivity to chemotherapeutic agent of lung adenocarcinoma cell line A549 and subcutaneous implanted tumor of nude mice. Inhibiting the PI3K/Akt signaling pathway can increase the chemotherapeutic sensitivity of lung adenocarcinoma. Key words：Lung carcinoma ;Apoptosis; LY294002; Paclitaxel liposome 肺癌是当今世界常见的恶性肿瘤，全身化疗是目前大多数肺癌患者的主要治疗手段，而肺癌细胞的耐药性是化疗失败的一个主要原因。近年的研究发现，PI3K/Akt的活化能够抵抗放、化疗引起的细胞凋亡，PI3K/Akt的抑制剂能够增强肿瘤对放、化疗的敏感性[12]。但其机制尚不完全清楚。我们联合应用PI3K/Akt的抑制剂LY294002及化疗药物紫杉醇脂质体作用于体内外的肺腺癌细胞，探讨PI3K/Akt抑制剂对肺腺癌化疗效果的影响。1 材料与方法 1.1 材料 细胞株A549（中科院上海细胞生物研究院）；F12K培养基、LY294002及噻唑蓝(MTT) （Sigma公司）；胎牛血清（中国医学科学院生物工程研究所）；紫杉醇脂质体（商品名：力扑素，南京思科药业有限公司，国药准字H20030357）；裸鼠(北京大学医学院)。 1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养 A549细胞用F12K培养基，于37℃、5% CO2培养箱内培养，0.25%的胰蛋白酶消化传代。 1.2.2 MTT比色分析法检测LY294002对A549细胞生长抑制作用 取对数生长期A549细胞按1×104/孔接种于96孔培养板，每孔200 μl。培养24h后换液，设空白调零组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶剂)及实验组(加紫杉醇，紫杉醇浓度依次为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8μg/ml，每组LY294002终浓度分别为20μmol/L)，每组设6个复孔。培养48h后加入MTT(5g/L)20μl，培养4h后加DMSO 150μl/孔，在酶联免疫测定仪上选择波长490nm，测定各孔吸光度Ａ值。计算细胞生长的抑制率，抑制率=(1-实验组Ａ平均值/对照组Ａ平均值)×100%。 1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率 取对数生长期的A549细胞接种于培养瓶，加入上述不同浓度的药物（LY294002终浓度为20μmol/L，紫杉醇的终浓度为0.4μg/ml），培养48h后获取细胞， 4℃、70%冷乙醇固定。上机检测细胞周期和细胞凋亡率。 1.2.4 Western blot法检测pAkt蛋白表达 同1.2.3方法收集细胞，裂解液裂解细胞后，加入pAkt单克隆抗体，图像分析系统测定各条带的吸光度A值作pAkt蛋白定量分析。 1.2.5 裸鼠移植瘤模型的建立与干预 24只裸鼠，均为雌性，鼠龄为3～4周，体重约18～20g。随机分为四组，每组6只，于裸鼠右上背部皮下接种A549细胞。待一周后肿瘤长出。（1）LY294002组： LY294002 25mg/kg，腹腔注射，每周2次；（2）对照组：等量生理盐水，腹腔注射；（3）紫杉醇组：紫杉醇20mg/kg，腹腔注射；（4）LY294002+紫杉醇组：紫杉醇20mg/kg＋LY294002 25mg/kg，腹腔注射；用药3周。实验结束称重瘤结节，计算抑瘤率：抑瘤率＝（对照组瘤结节重量－LY294002组瘤结节重量）/对照组瘤结节重量×100％。各组裸鼠肝、胃及肠组织做HE染色。 1.3 统计学方法 计量资料用±s表示，用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析和Pearson相关分析，率的比较采用χ2检验，Ｐ<0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1 LY294002联合DDP对A549细胞生长的抑制效应 MTT比色结果显示：LY294002对A549细胞增殖有抑制作用，并有剂量、时间依赖性[3]，见表1。根据该抑制效应选用浓度为20μmol/L的LY294002作为与DDP联合的干预浓度。 紫杉醇单独作用于A549细胞，随着浓度的增加，抑制率再增大，当浓度达到0.4μg/ml时，其抑制率达到56.08％; 当浓度再增加时，其抑制率并不增加，无剂量效应关系(r＝0.620，P>0.05)。当LY294002＋紫杉醇各浓度组与药物单用相比，对A549细胞的抑制率呈增加趋势, 见表2。 2.2 LY294002对A549细胞pAkt蛋白表达的影响 Western blot蛋白定量结果显示：LY294002可抑制pAkt蛋白的表达，且与LY294002干预浓度呈剂量依赖关系（r＝－0.913，P<0.05），见表3。 2.3 LY294002与紫杉醇联用对A549细胞周期及凋亡率的影响 LY294002、紫杉醇及LY294002与紫杉醇联用干预A549细胞后，各药物组凋亡率与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.01）；紫杉醇＋LY294002组凋亡率与LY294002组及紫杉醇组相表1 LY294002对A549细胞生长的抑制效应Compared with corresponding control group,all P<0.01比差异均有统计学意义（P<0.05）。细胞周期分布与对照组相比都发生变化，LY294002+紫杉醇组与紫杉醇单独作用于A549细胞相比，G0/ G1期细胞增多，差异有统计学意义（P<0.05），见表4。 2.4 LY294002联合DDP对裸鼠移植瘤生长的影响 裸鼠皮下接种A549细胞后，约一周左右见皮下移植瘤出现，呈圆形或椭圆形结节。在实验过程中，各组裸鼠均未出现明显的精神、进食、排便异常及死亡，各组间裸鼠体重无明显差异（P>0.05）。LY294002、紫杉醇及LY294002＋紫杉醇组瘤结节重量均低于对照组（P均<0.01）。LY294002＋紫杉醇组瘤结节重量低于LY294002组和紫杉醇表4 LY294002联合紫杉醇对A549细胞周期的影响P<0.05组，差异有统计学意义（P均<0.01）。提示LY294002与紫杉醇均能抑制裸鼠移植瘤的生长，两者联合应用抑瘤作用强于单独应用，见表5。3 讨论 肺癌发病率逐年增高，其中非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC) 约占肺癌发病率的85％，其中55％的NSCLC 患者就诊时已是ⅢB～ Ⅳ期，失去了手术治疗机会。化疗是此类患者的主要治疗方法，但是肿瘤细胞通过一系列适应性反应逃避化疗药物对它的杀伤作用，从而导致化疗效果并不理想。引起肿瘤细胞耐药的机制很多，其中PI3K/Akt通路具有调节细胞的增殖、生存和分化表5 LY294002联合杉醇质脂体对裸鼠移植瘤生长的抑制效应:P<0.01等功能，PI3K可上调抗凋亡基因的表达，抑制由cmyc诱导的细胞凋亡[4]。因此推测P13K信号转导通路可能在多细胞耐药中发挥作用。最近肿瘤分子靶向治疗研究发现信号转导途径与肿瘤进展和放、化疗抵抗有密切的关系，PI3K/Akt抑制剂在体外可抑制多种肿瘤细胞的生长，导致肿瘤细胞凋亡[56]。 本实验研究发现，紫杉醇与LY294002联合应用有提高紫杉醇对肺腺癌细胞A549的抑制效果的趋势，可增加其凋亡率，同时联合应用可明显地抑制肺癌移植瘤的生长，而本实验中紫杉醇与LY294002联合应用与紫杉醇单用对肺癌细胞的抑制率有增高的趋势，两者相比没有统计学意义，而对于移植瘤的抑制有统计学意义，分析其原因可能与LY294002体内外效果不同有关，也可能与细胞株有关，但总体说明抑制PI3K/Akt信号转导途径可以增强紫杉醇对人肺腺癌A549细胞的杀伤作用，PI3K/Akt信号转导途径的活化可能是导致肿瘤细胞发生耐药的一个重要原因。Akt抑制细胞凋亡的机制可能有以下几种：（1）通过磷酸化forkhead家族转录因子，从而阻止其发挥调节凋亡相关基因转录功能[78]；（2）激活的Akt使IKK介导的IκB降解和NFκB激活[9]，从而诱导抗凋亡基因Bcl2、BclXL的表达；(3)活化的Akt可直接磷酸化cAMP应答元件结合蛋白(CREB)的Ser133位点，使CREB连接到相应的启动子区，诱导CAMP反应元件、Bcl2、cfos等相关基因的表达；（4）PI3K依赖性的Akt的激活，可以使Bad的Ser136位点磷酸化，Bad与Bcl2或BclXL不能形成异二聚体，游离的Bcl2或BclXL则恢复了抗凋亡作用，有效阻断Bad诱导的细胞凋亡。另外的研究表明PI3K/Akt的底物之一P70s6k也能够磷酸化Bad[10]。本研究中也发现，联合应用LY294002能够显著地增加肺腺癌细胞的凋亡率，这说明抑制PI3K/Akt信号转导途径能够有效地提高药物诱导的肿瘤细胞凋亡。 通过抑制PI3K/Akt信号转导通路，促进细胞凋亡来增强肺癌细胞的化疗效果，为我们进一步提高肺癌患者的生存质量和生存率，提供了新的思路，细胞凋亡的启动是一个复杂的涉及多基因过程， LY294002诱导A549细胞凋亡的过程中是否有调控基因的活性、表达和转录的改变等机制，将是今后的研究方向，这将为LY294002成为治疗肿瘤的可能药物提供理论依据。【参考文献】[1] Brognard J, Clark AS, Ni Y, et al. 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