结肠癌及癌旁组织中TKTL1的表达

结肠癌及癌旁组织中TKTL1的表达作者：杨书雄， 郑丽端，杨菊红    作者单位：1.434200 湖北省松滋市人民医院病理科;2.华中科技大学同济医学院附属协和医院病理科    【摘要】  目的 探讨转酮酶样基因TKTL1在人类结肠癌发生发展中的作用。方法 用实时定量PCR检测结肠癌及癌旁组织中转酮酶样基因TKTL1 mRNA表达水平，连续监测法检测各组织中总转酮酶活性。结果 TKTL1 mRNA在结肠癌组织中比癌旁组织中的表达明显增强，且侵袭性结肠癌比非侵袭性结肠癌表达增强。同样，结肠癌组织中总转酮酶活性比癌旁组织中高(P<0.01)，侵袭性结肠癌较非侵袭性结肠癌中转酮酶活性增高(P<0.01)。结论 TKTL1 mRNA表达与人类结肠癌的发生发展密切相关。     【关键词】  结肠癌； 转酮酶样基因1； 实时定量聚合酶联反应     Expression of TKTL1 mRNA in Colon Cancer and Paracancer Tissue YANG Shuxiong1，ZHENG Liduan2，YANG Juhong2 1.Department of Pathology, The People's Hospital of Songzi City in Hubei Province, Songzi 434200, China; 2.Department of Pathology, Union Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science ＆ TechnologyAbstract：Objective   To explore the effect of TKTL1 on occurrence and development of colon cancer. Methods  Realtime PCR was used to determine the mRNA expression of TKTL1 gene in human colon cancer and paracancer tissue. Continuous monitoring assay was used to determine total transketolase activity in the human colon cancer and paracancer tissue. Results  The expression of TKTL1 gene was significantly higher in the colon cancer tissues than paracancer tissue. Further more, the expression of TKTL1 gene was significantly upregulated in the invasive colon cancer compare with the noninvasive colon cancer. The total transketolase activity significant increase in the colon cancer tissues compare with paracancer tissue. The total transketolase activity significant increase in the invasive cancer tissue compare with the noninvasive colon cancer. Conclusion  Expression of TKTL1 mRNA is related to the occurrence and development of human colon cancer.    Key words：Colon cancer； Transketolaselike gene 1(TKTL1)；Realtime PCR    结肠癌是人类常见的恶性肿瘤，它的发病原因还不十分清楚，可能是多种因素综合所致。近来研究发现，一些恶性肿瘤细胞中存在代谢异常现象，尤其是糖代谢的异常增强[1]。最近发展起来的正电子发射断层照相术（PET），其应用原理就是通过示踪剂监测肿瘤细胞代谢的变化－主要是糖代谢变化来早期诊断肿瘤。本研究利用实时定量PCR技术检测65例结肠癌及其癌旁组织中转酮酶样基因1（transketolaselike gene 1，TKTL1）的表达情况，并用连续检测法观察各组织中转酮酶活性的改变，探讨TKTL1在结肠癌发生发展中的作用。1  资料与方法    1.1  临床资料    本研究中65例结肠癌组织及相应的癌旁组织来源于2005年1月～2006年1月武汉协和医院手术切除标本，其中非侵袭性结肠癌(原位癌)11例，侵袭性结肠癌54例，癌旁组织取自肿瘤边缘5cm外区域，为肉眼下“正常”组织，上述组织切除后立即放入-70℃冰箱中备用；按国际抗癌联合会TNM分期标准（1997年）54例侵袭性结肠癌分为：Ⅰ期12例，Ⅱ期13例，Ⅲ期13例，Ⅳ期16例。所有患者中，男34例，女31例；年龄最小者36岁，最大者79岁，中位年龄为56岁，平均60.3岁，所有患者均术前未经化疗或放疗。    1.2  试剂及仪器    D5磷酸核糖二钠盐、5磷酸木酮糖、磷酸甘油醛异购酶和NADH （美国Sigma公司）；Trizol （美国Invitrogen公司）；ReverTraAceαTM 逆转录试剂盒（日本Toyobo公司）；考马斯亮蓝 G250（美国Amresco公司）；Taq酶（美国MBI公司）；ELX800酶标仪（美国BIOTEK公司）；UV1601紫外分光光度计（日本岛津公司）；核酸电泳仪(中国 北京六一仪器厂)；Lightcycler荧光PCR 仪（瑞士Roche公司）。    1.3  总RNA提取和cDNA的合成    取-70℃冰箱内存放的结肠癌组织和癌旁组织，每份标本切取约50mg放入匀浆器中，加入1ml TRIzol匀浆，从细胞中提取总RNA，然后用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，合成体系、反应条件参照试剂盒中的说明，体系如下：RNase Free H2O 6μl，5×RT Buffer 4μl，dNTPs (10mmol/L) 2μl，RNase inhibitor (107u/L) 1μl，随机引物(25μmol/L) 1μl，RNA 5μl，Rever TraAce(2×108u/L) 1μl，总体积为20μl；反应条件：30℃ 30min, 42℃ 20min, 99℃ 5min, 4℃ 5min。    1.4  实时定量RTPCR    TKTL1基因的实时荧光定量扩增在Lightcycler荧光PCR仪中进行，扩增条件：94℃预变性5min；接着进行40个循环，包括94℃变性5s，57℃退火5s，72℃延伸10s后进行荧光检测。然后进行熔解曲线分析，由65℃以0.2℃/s上升至95℃；最后冷却至40℃，记录各基因的熔解曲线（见图1）和Ct值，各基因扩增后最终的表达结果用2-△△ct相对定量法表示[2]。具体公式如下：△Ct= Ct(target) -Ct(βactin),△△Ct=△Ct(target)-△Ct(control), mRNA relative amount=2-△△Ct。转酮酶基因（TKTL1）扩增时所需引物参考文献[3]：5′TAA CAC CAT GAC GCC TAC TGC 3′; 5′CAT CCT AAC AAG CTT TCG CTG3′，扩增产物片段为150bp。βactin基因扩增时所需引物根据Genbank中提供的基因序列应用软件primer premier 5.0设计，序列如下：5′GTG CGT GAC ATT AAG GAG3′(上游)；5′CTA AGT CAT AGT CCG CCT3′(下游)，扩增产物片段为520bp。    It showed primer dimmer that the melting out temperature(80.6℃) of spinnacle is low.  It show objective production that the melting out temperature(84.8℃) of spinnacle is high    图1  溶解曲线    Fig 1  Solubility curve    1.5  转酮酶活性测定    组织抽提物的制备：各组用匀浆器进行匀浆，将细胞用PBS清洗后加入冷裂解缓冲液（50mM Tris/HCl，150mM NaCl，1% TritonX100，100μg/ml PMSF，5μg/ml Leupeptin, 5μg/ml Aprotinin）中，0℃裂解30min，10 000r/min离心15min，取上清液作为转酮酶活性测定的样本。转酮酶活性测定：酶活性测定试剂含50mM Tris/HCl，2mM 5磷酸核糖，1mM 5磷酸木酮糖，5mM MgCl2 ，0.2u/ml TPI，0.2 mM NADH和0.1mM TPP。转酮酶测定方法参照文献[4]。组织抽提物样本中蛋白浓度测定采用Bradford法。上述实验重复3次，结果以3次实验的平均值计。    1.6  统计学方法    统计学分析采用统计软件SPSS10.0，用独立样本的t检验对各组资料应进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。2  结果    2.1  TKTL1在结肠癌组织中的表达    利用实时定量PCR检测各组组织中TKTL1基因mRNA表达情况，采用2-△△ct相对定量法计算结肠癌组织相对于癌旁组织中TKTL1 mRNA表达的相对量。癌旁组织为1.24±0.11，非侵袭性结肠癌为3.26±0.18，侵袭性结肠癌为5.82±0.39。统计学结果显示TKTL1在结肠癌组织中比癌旁组织中的表达明显增强（t＝5.38，P<0.01），且侵袭性结肠癌比非侵袭性结肠癌表达增强（t＝4.27，P<0.01）。从各组织中TKTL1扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析图中也可以看到同样的结果，见图2。    2.2  各组织中转酮酶活性    转酮酶的活性以每分钟生成产物的量（ng）与细胞总蛋白（mg）的比值来表示。上述实验重复3次，结果以3次实验的平均值计，各组织中转酮酶活性平均值见表1。表中资料提示结肠癌组织（侵袭性和非侵袭性）中转酮酶活性较癌旁组织明显增强，且侵袭性结肠癌组织中转酮酶活性较非侵袭性强。这些结果说明转酮酶活性在结肠癌发生发展中起重要作用。表1  结肠癌及癌旁组织中转酮酶活性    非侵袭性结肠癌组织中转酮酶活性与癌旁组织相比，P<0.01;侵袭性结肠癌组织中转酮酶活性与癌旁组织相比，P<0.01;侵袭性结肠癌组织中转酮酶活性与非侵袭性结肠癌组织相比，P<0.013  讨论    目前研究认为，恶性肿瘤是细胞增殖调控基因整体或功能受损害引起的一种复杂的基因现象[5]。恶性肿瘤细胞的快速生长和增殖需要大量的能量和核酸合成，而核酸合成主要来自于糖代谢中磷酸戊糖途径的非氧化部分，转酮酶是磷酸戊糖途径的非氧化部分限速酶。Boros等[6]研究发现，核苷酸合成的必需成分——核糖的85％以上直接或间接来自PPP途径。Cascante等[7]对肿瘤细胞代谢特点分析表明：转酮酶激活剂（硫胺素）可通过调节转酮酶活性增加核苷酸的主要成分——磷酸核糖的合成量，而核苷酸的合成是肿瘤细胞的存活、对化疗药物的抵抗及其生长增殖所必需，而转酮酶抑制剂的作用则与之相反。    目前已知的人类基因组中转酮酶基因家族包括TKT、TKTL1和TKTL2。Langbein等[8]研究发现，一些恶性肿瘤中TKTL1在mRNA和蛋白质水平均是上调的，而TKT和TKTL2不上调，且TKTL1的表达上调与膀胱癌的预后有关。Staiger等[9]发现，TKTL1的表达上调是胃癌的普遍现象，他认为TKTL1可作为胃癌治疗研究的新靶点。Vlker等[10]研究认为，TKTL1的过度表达与喉癌的预后有关。我们用实时定量PCR检测了65例结肠癌及其相对应的癌旁组织TKTL1的表达情况，结果发现TKTL1在结肠癌组织中比癌旁组织中的表达明显增高，且侵袭性结肠癌比非侵袭性结肠癌表达增高。各组织中转酮酶活性检测显示，结肠癌组织中总转酮酶活性比癌旁组织中高，侵袭性结肠癌较非侵袭性结肠癌中转酮酶活性增高。这些结果提示TKTL1的高表达可能与恶性肿瘤的发生发展有关。    既然TKTL1的高表达与恶性肿瘤的发生发展有关，能否通过抑制TKTL1的表达而使转酮酶活性降低，进而抑制肿瘤细胞的核酸合成，最终抑制肿瘤细胞的生长和增殖呢？Hu等[2]研究发现，人类肝癌细胞系（HepG2）中TKTL1高表达，TKT和TKTL2表达不上调，利用小干扰RNA技术抑制TKTL1的表达后，细胞总转酮酶活性明显下调，且癌细胞的生长增殖明显受抑制。Zhang等[4]在人类结肠癌细胞（LoVo细胞系）中的研究也得到相似的结果。这些结果说明TKTl1在总转酮酶活性中起主要作用，在恶性肿瘤细胞的生长和增殖中起重要作用。    总之，TKTL1的高表达可能与结肠癌的发生发展中起重要作用，我们将在更多的肿瘤中研究TKTL1的表达，相信TKTL1成为肿瘤治疗研究的新靶点。【参考文献】［1］ Ramanathan A,Wang C, Schreiber SL. 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