Stat3信号转导通路调控Caspase3表达促进结肠癌细胞凋亡的机制

【摘要】  目的 本研究探讨Stat3/Caspase3信号转导通路调控结肠癌细胞凋亡的作用机制。方法 用阳离子脂质体介导Stat3反义寡核苷酸转染人结肠癌HT29细胞，MTT法检测细胞增殖状态；流式细胞术检测细胞周期与凋亡；Western blot检测Stat3、pStat3、Caspase3与Bcl2凋亡家族成员Bcl2和BclxL的表达。结果 转染Stat3反义寡核苷酸后HT29细胞增殖受抑制，凋亡细胞增多，Stat3，pStat3与Caspase3表达下降，Bcl2与BclxL变化不明显。结论 阻断Stat3通路可以抑制靶基因Caspase3表达并诱导结肠癌细胞凋亡。

【关键词】  结肠癌 信号转导 凋亡 胱冬肽酶

   0  引言

    Stat3是转录信号传导子与激活子通路（Signal Transducers and Activators of Transcription，STATs）的重要成员，该通路接受生长因子与细胞因子等细胞外信号刺激，调节细胞增殖、分化及凋亡[1]。目前已发现Stat3在白血病、头颈部鳞癌及乳腺癌等多种肿瘤组织及细胞系中呈持续活化[2]。Caspase3是重要的凋亡抑制因子，在许多肿瘤组织中均可见Caspase3的异常高表达[3]。Caspase3可以抑制由多种刺激诱导的凋亡，但关于Caspase3在结肠癌发生发展过程中的作用还有待进一步研究[4]。本研究通过阻断结肠癌细胞中Stat3通路，探讨Stat3/Caspase3信号转导通路调控结肠癌细胞凋亡的机制。

    1  材料与方法

    1.1  细胞培养

    人结肠癌细胞HT29，培养于含有10%胎牛血清（美国HyClone公司）的RPMI1640培养基（美国GIBCOL/BRL公司）。

    1.2  Stat3寡核苷酸的合成与纯化

    Stat3反义寡核苷酸根据Stat3翻译起始点合成，同时本研究还设立了正义寡核苷酸链和错配寡核苷酸链作为对照组，错配链的序列在GenBank数据库进行同源性检索，未发现同源序列。Stat3反义寡核苷酸序列：5’ CCATTGGGCCATCCTGTTTCT 3’；Stat3正义寡核苷酸序列：5’ AGA AACAGGATGGCCCAATGG 3’；Stat3错配寡核苷酸序列：5’ CCATTGCGCCATCGTGTTACT 3’。以上寡核苷酸由美国Santa Cruz公司合成及纯化。

    1.3  阳离子脂质体转染

    LipofectAmine2000 （美国GIBCOL/BRL公司），转染过程参照GIBCOL/BRL公司手册。分为空白对照组、正义寡核苷酸组、错配寡核苷酸组与反义寡核苷酸组。

    1.4  细胞增殖状态检测（MTT法）

    接种细胞于96孔板，贴壁后，无血清培养细胞16～24h，使细胞同步化。实验分4组进行，即空白对照组、正义寡核苷酸组、错配寡核苷酸组与反义寡核苷酸组。每个研究点设置3组平行对照，重复3次实验取平均值。空白对照组加无血清培养基，正义寡核苷酸组、错配寡核苷酸组与反义寡核苷酸组分别加入脂质体及Stat3正义寡核苷酸、错配寡核苷酸与反义寡核苷酸至浓度达到0、5、10、20μM，第0、24、48、72h分别加入MTT 5mg/ml （美国Sigma公司），继续培养4h，每孔加入DMSO 200μl，酶标仪测定540nm吸收值，绘制生长曲线。

    1.5  细胞周期检测

    无血清培养细胞16～24h，使同步化，空白对照组加无血清培养基，正义寡核苷酸组、错配寡核苷酸组与反义寡核苷酸组分别加入脂质体及Stat3正义寡核苷酸、错配寡核苷酸与反义寡核苷酸继续培养，第0、24、48、72h分别消化细胞，0.5ml PBS重悬细胞，70%冰乙醇固定细胞过夜，加入RNAase A至终浓度50μg/ml，37℃恒温水浴1h，加入碘化丙啶（美国Sigma公司）至终浓度50μg/ml，4℃避光染色1h，上流式细胞仪FACScan（美国BectonDickinson公司）检测，资料用Cell Quest细胞周期分析软件处理。

  1.6  细胞核蛋白与总蛋白提取

    1.6.1  细胞核蛋白提取  收集细胞悬液；用低渗缓冲液于冰上裂解细胞10 min；4℃条件下13 000 r/min离心1min；4℃条件下用高盐缓冲液重悬粗提的细胞核，振荡30min；4℃条件下13 000r/min离心10min；取上清为核提取物，贮存于80℃于2个月内用完。

    1.6.2  总蛋白提取  参照Santa Cruz公司蛋白提取方法，应用RIPA缓冲液裂解结肠癌细胞得到总蛋白。

    1.6.3  蛋白浓度测定方法（Bradford法）  以牛血清蛋白（BSA）作为标准品，根据蛋白定量试剂盒（美国BioRad公司）说明绘制蛋白定量标准曲线，于分光光度计595nm下测光密度值，计算提取液蛋白浓度。

    1.7  Western blot

    细胞蛋白样品50μg上样于7.5%的聚丙烯酰胺凝胶经电泳分离后，电转移至PVDF膜（美国Millipore公司），封闭后，加入一抗（Stat3，pStat3，Caspase3，Bcl2，BclxL，GAPDH）（美国Santa Cruz公司），工作浓度1∶1000；辣根过氧化物酶结合的二抗（英国Amersham公司），工作浓度1∶1000。用ECL（英国Amersham公司）化学发光试剂盒检测杂交信号。

    1.8  吸光度测定

    用PhosphoImager图像分析仪（美国Molecular Dynamics公司）测定条带的吸光度A，以A值代表蛋白的相对表达量。

    1.9  统计方法

    应用SPSS 12.0统计学软件，采用独立样本t检验，P＜0.05为有统计学差异，差异有显著性。

    2  结果

    2.1  Stat3反义寡核苷酸可以抑制结肠癌细胞增殖

    Stat3反义寡核苷酸作用HT29细胞72h后，G1期细胞比率由61.40%上升至75.60%，S期细胞比率由21.38%下降至11.72%，细胞增殖受抑制，见表1。表1  HT29细胞周期比率检测

    2.2  Stat3反义寡核苷酸可以促进结肠癌细胞凋亡

    HT29细胞在转染Stat3反义寡核苷酸72h后，凋亡细胞百分比由5.60%增加至25.51%，见表2。表2  HT29细胞凋亡比率检测（

    2.3  Stat3反义寡核苷酸可以使Stat3信号传导通路成员活性与表达下降

    HT29细胞转染Stat3反义寡核苷酸72h后，Stat3蛋白表达与活性下调，其靶基因产物Caspase3表达下降，Bcl2与BclxL变化不明显，见图1。

    图1  Western blot 检测Stat3反义寡核苷酸作用于结肠癌HT29细胞72 h后，Stat3通路成员蛋白表达变化

    3  讨论

    JAKs/STATs信号转导通路与细胞的增殖、分化及凋亡关系密切，该通路异常活化可导致细胞异常增殖和恶性转化。关于Stat3信号转导通路在结肠癌发生发展中的作用机制尚有待于进一步研究[5,6]。

    癌基因Stat3通过激活靶基因而诱导某些关键产物的表达来影响肿瘤的发生，重要的靶基因产物包括影响细胞凋亡的Bcl2家族成员。Bcl2家族包括抑凋亡和促凋亡两大类，前者包括Bcl2、BclxL、Mcl1等，后者包括Bax、Bak、BclxS等[7]。阻断肿瘤细胞中Stat3通路后，肿瘤细胞增殖受抑制并促进凋亡发生[8]。然而Bcl2家族成员表达并非是决定细胞凋亡与否的唯一因素，其翻译后修饰也是调节细胞调亡的关键因素之一。胱冬肽酶（Caspase）是一类天冬氨酸残基特异性的半胱氨酸蛋白酶[9]，在细胞凋亡过程中起关键作用，它们对Bcl2家族的蛋白质具有重要的酶解修饰作用，目前已发现的属于这类蛋白酶家族的成员已有十余种，包括Caspase1～10等，而Caspase3是此家族的重要成员。Yamashita等[10]发现乳腺癌细胞中Caspase3受STATs通路调控，而Caspase3阴性的细胞不受影响。本研究应用Stat3反义寡核苷酸转染结肠癌细胞系HT29，可以阻断其内源性Stat3信号转导通路，Stat3及磷酸化Stat3表达下调，凋亡细胞增加，Caspase3表达下降，但是Bcl2与BclxL变化不明显。其作用机制可能为阻断HT29细胞中Stat3通路后，失活状态的Stat3不能与Caspase3启动子结合，从而抑制Caspase3表达，细胞出现凋亡。

 总之，Stat3信号转导通路在结肠癌细胞中的转录调控机制尚不清楚，Stat3通路异常激活与结肠癌细胞凋亡的机制还有待于进一步明确。实验动物模型及临床观察中发现：肿瘤细胞耐受化疗与Stat3和Caspase3异常增高有关[11,12]，阻断Stat3通路可诱导耐药肿瘤细胞凋亡。深入研究Stat3信号转导通路调控Caspase3的作用机制有可能为治疗结肠癌提供新的理论和实验基础[13]。

【参考文献】  ［1］ Haura EB, Turkson J, Jove R. Mechanisms of disease: Insights into the emerging role of signal transducers and activators of transcription in cancer[J]. Nat Clin Pract Oncol, 2005, 2(6):315324.

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［6］ 马向涛, 王杉, 杜如昱, 等. JAK激酶抑制剂AG490联合5氟尿嘧啶抑制结肠癌细胞STAT3信号转导通路的研究[J]. 中华实验外科杂志, 2003, 20(10):874876.

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［10］Yamashita H, Iwase H, Toyama T, et al. Naturally occurring dominantnegative Stat5 suppresses transcriptional activity of estrogen receptors and induces apoptosis in T47D breast cancer cells[J]. Oncogene, 2003, 22(11):16381652.

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［13］马向涛,王杉,杜如昱,等. Stat3反义寡核苷酸联合化疗调控结肠癌细胞增殖与凋亡的分子机制[J]. 中华实验外科杂志, 2004, 21(10):12121214.