p73、PTEN和Ki67在子宫内膜样腺癌组织中的表达及意义

【摘要】  目的 探讨p73、PTEN和Ki67蛋白在子宫内膜癌前病变及内膜样腺癌中的表达及意义。方法 用免疫组化SP法，在13例子宫内膜正常增生期、20例简单型增生过长、22例复杂型增生过长（包括11例不典型增生）及38例内膜样腺癌组织中检测p73、PTEN和Ki67蛋白的表达情况。结果 随着子宫内膜病变的恶性进展，p73和Ki67蛋白的阳性表达率上调而PTEN下调,且p73和Ki67表达上调呈显著正相关（P＜0.01）,Pearson列联系数为0.5144。p73和Ki67蛋白表达与子宫内膜样腺癌组织分化程度有关（P＜0.01）, Ki67和PTEN蛋白表达与子宫内膜样腺癌的临床分期和肌层浸润有关（P＜0.05）。结论 p73和Ki67协同调控子宫内膜腺上皮细胞的生长、增殖，并促进癌变;PTEN表达下调是子宫内膜样腺癌的早发事件。联合检测p73、Ki67和PTEN 蛋白的表达可作为在子宫内膜癌早期诊断的参考指标并指导临床早期治疗。

【关键词】  子宫内膜样腺癌 p73 PTEN Ki67 免疫组织化学

    0  引言

    人类肿瘤的形成与多因素有关，随着分子生物学技术和实验技术的普及，基因标志物和基因治疗已成为肿瘤研究的热点。p73和PTEN均是新发现的基因，子宫内膜癌发生发展过程中p73、PTEN和Ki67相关性研究国内外未见文献报导。本研究中采用免疫组化SP法探讨p73、PTEN和Ki67表达与子宫内膜样腺癌发生、发展的关系及相关性，寻找早期和癌变过程中阶段性的标志物，为早期诊治子宫内膜样腺癌提供理论依据。

    1  资料和方法

    1.1  病例资料  收集湖北襄樊市第一人民医院病理科1993～2001年存档的石蜡包埋子宫内膜标本，其中内膜样腺癌38例（高分化28例，中低分化10例），正常增生期13例，简单型增生过长20例，复杂型增生过长22例（包括11例不典型增生过长）。所有病例均经有经验的临床和病理专家确诊。选择的研究对象在诊刮或手术之前均无激素替代治疗及放化疗病史。

    1.2  试剂  p73兔抗人多克隆抗体(SC7957)浓缩液(工作浓度1∶100)，通用型SP试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。Ki67鼠抗人单克隆抗体(MAB0129)，PTEN鼠抗人单克隆抗体(MAB0369)，鼠SP试剂盒购自福州迈新生物技术公司。

    1.3  方法  取存档蜡块制成4μm厚的切片，采用免疫组化SP法染色。石蜡切片经脱蜡和水化后，用高压修复p73和Ki67抗原：0.01M枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）烧开后，放入切片上阀继续加热，待上气维持90秒后取下自然冷却;用微波修复PTEN抗原，之后的操作步骤严格按试剂盒说明书进行，用PBS代替一抗作阴性对照。

    1.4  结果判断  以细胞胞核或胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性。高倍镜下每张切片选5个视野,每个视野记数100个细胞,其中阳性细胞数≥25%为阳性表达,＜25%为阴性表达[1]。

    1.5  统计学处理  采用χ2检验和四格表确切概率法及计数资料的相关分析法。

    2  结果

    2.1  p73、PTEN和Ki67蛋白表达情况

    p73蛋白定位于细胞核和细胞浆内（见图1、3）；Ki67蛋白表达定位于细胞核内（见图2、4）；PTEN定位于细胞浆内（见图5、6）。经统计学处理，正常增生期、简单型增生过长、复杂型增生过长子宫内膜p73和Ki67蛋白阳性表达率明显低于子宫内膜样腺癌组织，差异有极显著性(P＜0.01)；而PTEN蛋白阳性表达率明显高于子宫内膜样腺癌组织，差异亦具有显著性（P＜0.05），见表1。

   图1  简单型增生过长中p73胞核和胞浆表达，SP×400  图2  简单型增生过长中Ki67胞核表达，SP×400  图3  高分化癌中Ki67胞核表达，SP×200  图4  高分化癌中p73胞核和胞浆表达，SP×400  图5  复杂型增生过长中PTEN胞浆表达，SP×400  图6  高分化癌中PTEN胞浆表达，SP×200表1  p73、PTEN和Ki67蛋白在不同子宫内膜中阳性表达情况

    2.2  各蛋白表达与子宫内膜样腺癌临床分期、分化程度及肌层浸润的关系

    p73蛋白阳性表达率与临床分期及肌层浸润无明显关系 （P＞0.05），而与分化程度有关（P=0.0402）；PTEN蛋白阳性表达率在临床分期中Ⅰ期与Ⅲ+IV期相比差异有显著性（P=0.0319），与肌层浸润有关（P=0.0129），而与分化程度无明显的相关性（P=0.2702）；Ki67蛋白阳性表达率在临床分期中Ⅰ期与Ⅲ+IV期相比差异有显著性（P=0.0112），与分化程度有关（P=0.0189），且与肌层浸润也有显著关系（P=0.0132），见表2。

    2.3  p73蛋白与PTEN、Ki67蛋白表达的相关性

    利用计数资料的相关性分析，在子宫内膜样腺癌中p73蛋白与Ki67蛋白阳性表达高度正相关（P=0.0002），Pearson列联系数为0.5144；而与PTEN无明显相关性（P=0.1226），见表3。表2  p73、PTEN和Ki67与临床分期、肌层浸润及分化程度的关系表3  子宫内膜样腺癌中p73蛋白与 PTEN、Ki67蛋白的关系

    3  讨论

    p73基因是Kaghad等[2] 于1997年发现的p53家族的第一个新成员，定位于1p36.33。p73基因有5种经变位剪切的异构体α、 β、γ、δ、ε[2，3]，这5种异构体在人体组织中分布及功能不同，Pozinak[4]发现p73γ、δ可对抗p53的功能，p73α、 β能协同p53诱导细胞凋亡。本研究发现p73蛋白表达在子宫内膜增生期中呈低表达15.38%(2/13)，随增生程度逐渐上调，癌组织中阳性率76.32%(29/38)显著高于正常增生及复杂型增生过长组织（P＜0.01），而复杂型增生过长又显著高于正常增生组织（P＜0.05），这表明p73基因的表达上调是子宫内膜样腺癌发生过程中的一个重要事件，参与了子宫内膜样腺癌的发生机制。这结果与Mai等[5]和Tokuchi等[6]报导的p73在肺癌中的表达（87%）明显高于肺组织结果相似。本研究提示p73蛋白表达与组织学分化有关(P＜0.05)，说明p73在子宫内膜样腺癌的癌变过程中起作用。p73在子宫内膜样腺癌发生中的作用可能并非作为一个抑癌基因，或者可能在子宫内膜样腺癌组织中是p73γ、δ异构体占优势而对抗经典抑癌基因p53的功能。对p73基因的定位、突变及转录剪切机制值得进一步研究。

    PTEN定位于10q23，是第一个被发现的具有磷酸酶活性的抑癌基因。本研究结果显示正常增生期及复杂型增生过长子宫内膜中PTEN的阳性表达率显著高于内膜样腺癌组织，且PTEN与临床分期、肌层浸润均有密切关系（P＜0.05），随分化程度的降低，阳性表达率有降低趋势，但差异无显著性(P＞0.05)。Mutter等[7]研究发现，子宫内膜样腺癌中PTEN突变率为83%，癌前病变中达55%，而正常子宫内膜中没有PTEN突变。揭示PTEN下调可作为子宫内膜样腺癌早期及预测预后的生物学标记，PTEN可作为子宫内膜样腺癌基因治疗的候选基因。

    Ki67是除了细胞G0期，在细胞G1、S、M、G2期均会出现的核抗原，表达的高低，反映了细胞增殖的程度。本研究在子宫内膜样腺癌中Ki67阳性表达率为71.05%(27/38),与正常增生期及增生过长子宫内膜相比差异具有显著性（P＜0.05），且Ki67表达增高与组织分化程度、临床分期及肌层浸润有关（P＜0.05），提示增殖活性的改变与癌变的进展过程有关。

在子宫内膜样腺癌中p73与PTEN无明显相关性，而和Ki67表达上调呈显著正相关（P＜0.01），Pearson列联系数为0.5144，提示p73和Ki67协同调控子宫内膜腺上皮细胞的生长、增殖，并促进癌变。

    总之，肿瘤的发生是多基因作用的结果，各相关基因在肿瘤的发生发展中相互作用。联合检测p73、PTEN和Ki67三种蛋白的表达可作为子宫内膜样腺癌早期诊断的参考指标并指导临床早期治疗。当然,如能对大宗病例进行多指标多水平的联合检测,将会大大提高临床预后的预测效果,更好地指导临床治疗。

【参考文献】  ［1］ 李小华,陈德基,江曼,等.实验性肺癌癌变过程中p53、mdm2、Kras及PCNA蛋白的表达[J].癌症,2001,20(9):922.

［2］Kaghad M, Bonnet H,Yang A, et al. Monoallelically expressed gene related to p53 at 1p36, a region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers[J]. Cell, 1997,90(4):809819.

［3］ De Laurenzi V, Costanzo A, Burcaroli D, et al. Two new p73 splice rariants, gamma and delta, with different transcriptional activity[J].Exp Med, 1998,188(9):17631768.

［4］ Pozniak CD,Radinovic S,Yang A,et al. An antiapoptosis role for the p53 family member, p73, during development neuron death[J]. Science, 2000,289:304306.

［5］ Mai M, Yokomizo A, Qian C ,et al. Activation of p73 silence allele in lung cancer[J]. Cancer Res,1999,58(1):23472349.

［6］ Tokuchi Y, Hashimoto T, Kobayashi Y, et al.The expression of p73 is increased in lung cancer, independent of p53 gene alteration[J]. Br Cancer,1993, 80(10):16231629.

［7］ Mutter GL, Lin MC, Fitzgerald JT, et al. Altered PTEN expression as a diagnostic marker for the earlist endometrial precancers[J]. J Natl Cancer Inst, 2000, 92(11):861863.