shRNA介导Ku80基因沉默对食管癌细胞及裸鼠移植瘤生长的抑制作用

shRNA介导Ku80基因沉默对食管癌细胞及裸鼠移植瘤生长的抑制作用作者：杨青山，樊飞跃    作者单位：300192 天津，中国医学科学院放射医学研究所(*现工作单位:121001 辽宁锦州，辽宁医科大学附属一医院肿瘤科)    【摘要】  目的 利用shRNA抑制Ku80蛋白表达来研究Ku80对食管癌细胞和裸鼠移植瘤生长的影响。方法 采用RNA干扰技术，构建shRNAKu80载体。用Western blot和RTPCR方法证实RNA干扰的有效性和可行性。用MTT法、克隆形成实验和体内抑瘤实验来研究shRNA抑制Ku80表达对食管癌细胞和裸鼠移植瘤生长的影响。用流式分析法来研究shRNA抑制Ku80表达对细胞周期和凋亡的影响。结果 成功构建了shRNAKu80载体。shRNA抑制Ku80表达在体内外抑制食管癌细胞的生长。shRNA抑制Ku80表达使细胞周期阻滞于G2/M期，促进射线引起的凋亡。结论 Ku80在食管癌的发生、发展中起作用，shRNA抑制Ku80表达有望成为肿瘤基因治疗的靶点。    【关键词】  shRNA；Ku80；细胞增殖；凋亡    Inhibitory Effect of Silencing Ku80 by shRNA on Esophageal Carcinoma Cells and Its Transplanted Models in Nude Mice    YANG Qingshan*, FAN Feiyue    Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences，Tian jin 300192，Chian(*Present:Department of Oncology, The First Affiliated Hospital, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)Abstract：Objective   To investigate effect of Ku80 on esophageal carcinoma cells and its transplanted models in nude mice, inhibition of Ku80 expression by shRNA vector was used.Methods  shRNAKu80 vector was constructed, using RNA interference technology. The effectiveness and feasibility of RNA interference were confirmed by Western blot and RTPCR methods. Effects of silencing Ku80 by shRNA on esophageal carcinoma cells and its transplanted models in nude mice were investigated by MTT assay, Colony formation assay and inhibition of tumor assay in vivo. Effects of silencing Ku80 by shRNA on cell cycle and apoptosis were observed by Flow cytometry analysis.Results  ShRNAKu80 vector was constructed successfully. Silencing Ku80 by shRNA inhibited esophageal cells growth in vitro and in vivo. Silencing Ku80 by shRNA made cell cycle arrest in G2/M phase and enhanced apoptosis induced by radiation.Conclusion  Ku80 plays a role in occurrence and development of esophageal cancer, inhibition of Ku80 expression by shRNA may become a target of gene therapy of tumor.    Key words：shRNA；Ku80；proliferation；Apoptosis    Ku80是Ku70/80异源二聚体的一个组成单位，广泛存在于哺乳动物细胞内，最初是作为一种自身抗原发现于硬皮病患者的血清中[1]。目前已知Ku80的生物学功能有：参与DNA双链断裂的非同源末端连接（NHEJ）、V（D）J重组和维护端粒结构、调控特定基因转录等[2]。近年来，发现Ku80蛋白的活性与肿瘤的发生、发展相关[3]。为进一步探讨其在食管癌中的作用及其机制，本研究应用shRNA表达载体介导Ku80基因转染人食管癌细胞株，对其蛋白表达情况和体内外抑瘤作用进行了实验研究，为今后以Ku80为靶点的基因治疗提供实验依据。对其蛋白表达情况和体内外抑瘤作用进行了实验研究，为今后以Ku80为靶点的基因治疗提供实验依据。1  材料与方法    1.1  材料及主要试剂    RPMI1640培养基（Gibco），胎牛血清（Biowhittaker），Lipofectamine2000（Invitrogen），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天），兔抗人Ku80单克隆抗体（Cell signal），兔抗人βactin单克隆抗体和兔抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗（博士德），shRNAKu80由上海吉凯生物公司合成。合成的序列分别为：shRNAH: 5′CCAAATCCTCGATTTCAGATTCAAGAGATCTGAAATCGAGGATTTGG3′，shRNAK:5′GGAATTACCGAACAGCAAATTCAAGAGATTTGCTGTTCGGTAATTCC3′目的片段分别作用于Ku80编码区的619～639位和1 480～1 500位。同时试剂盒含有与人类基因无同源性的无关序列作为阴性对照。shRNASC: 5′ACGTGACACGTTCGGAGAATTCAAGAGATTCTCCGAACGTGTCACGT3′。    1.2  细胞培养    人食管癌细胞株EC9706由中科院肿瘤所惠赠,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在37℃、5%CO2条件下常规培养传代。    1.3  shRNA表达载体转染细胞与稳定筛选    在24孔培养板中常规接种EC9706细胞（2×105），培养24 h后换无血清培养基optiMEM 100 μl/孔孵育1 h，经Lipofectamine2000介导shRNA质粒转染EC9706细胞（按试剂盒说明书操作），转染后48 h，每孔加入600 μg/ml G418筛选阳性克隆，每3天更换一次培养液，10天后单克隆化扩大培养于含300 μg/ml G418培养液中。同时设一阴性对照转染细胞。    1.4  Western blot检测Ku80蛋白表达变化    收集各组细胞，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，上样量30 μg总蛋白，10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白质转移到PVDF膜上，用含50 g/L脱脂奶粉的TBST 4℃封闭过夜，分别加入兔抗人Ku80单克隆抗体（1:1 000稀释）或兔抗人βactin单克隆抗体（1:400稀释）4℃孵育过夜。TBST洗10 min×3次，兔抗兔辣根过氧化物酶标记二抗（1:5 000稀释）室温孵育2 h，TBST洗10 min×3次，用化学增强发光试剂盒（ECL）曝光底片显影、定影。    1.5  RTPCR检测Ku80 mRNA变化    用RTPCR法扩增各组细胞中的Ku80 mRNA，βactin作为内参。Ku80上游引物为5′GGGGTACCATGGTGCGGTCGGGGAAT3′；下游引物为5′GCTCTAGATCCCCATACATCCACGAC3′。产物2 200 bp。βactin上游引物为5′ACCGTGGAGAAGAGCTACGA3′；下游引物为5′GTACTTGCGCTCAGCGGAG3′。产物482 bp。94℃变性，60℃退火，72℃延伸，共35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳。    1.6  Ku80基因沉默对食管癌细胞增殖的影响    （1）MTT法：选择各组细胞，调整细胞数为2×105/ml接种于96孔培养板,每孔200 μl, 另设不加细胞的培养液为本底,分别培养1、3、5、7天，到时间点后每孔加入20 μl （5 mg/ml）MTT，继续培养4 h后终止培养，每孔加入DMSO 150 μl，充分振荡10 min，选择570 nm波长，酶标仪测定各孔的吸光度值（A）。（2）克隆形成实验: 各组细胞（103）室温下分别接种在100 mm培养皿中，培养14天后，肉眼可见克隆形成。经甲醇固定，0.5%结晶紫染色。在显微镜下计数细胞克隆数（至少含50个细胞）。    1.7  Ku80基因沉默对食管癌细胞周期和凋亡的影响    各组细胞培养24 h后，用胰酶消化并收集，PBS清洗，用预冷的75%乙醇于4℃固定过夜，离心，弃去固定液，PBS洗2次，加入含0.2 mg/ml RNaseA PI染液（50 μg/ml）， 4℃避光孵育30 min后, 用流式细胞仪检测细胞周期。用8 Gy 137Cs照射各组细胞作为凋亡诱导剂，照射后继续孵育24 h，然后收集各组细胞，用GENMEDTUNEL FACS试剂盒检测细胞凋亡情况。    1.8  Ku80基因沉默对食管癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用    SPF级Balb/C裸鼠共15只，由中国医学科学院基础所提供,裸鼠雌雄兼用,4周龄。随机分为3组。取各组细胞，用PBS调整细胞浓度到1×107/ml。在裸鼠腋下接种肿瘤细胞0.2 ml，观察裸鼠皮下肿瘤生长情况，每4天测量一次瘤体长短径，按V=1/2ab2（V为体积，a为长径，b为短径）计算肿瘤体积。    1.9  统计学方法    所有实验重复3次。数据用均数±标准差表示，进行多个实验组的均数与一个对照组均数比较的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。2  结果    2.1  shRNA有效抑制内源性Ku80蛋白表达    Western bolt 结果表明,稳定转染的shRNAH2和shRNAK3细胞Ku80表达被明显抑制，可达63%和50%（P<0.01）。其余转染细胞Ku80蛋白无明显变化。RTPCR结果也显示shRNAK3，H2的Ku80 mRNA含量明显减少（P<0.01），抑制率为58%和84%，见图1。我们用shRNAH2细胞进行后续实验。    2.2  ShRNAH2对食管癌细胞体外生长的影响    MTT法检测结果显示shRNAH2细胞生长明显受抑制,且随时间延长抑制作用逐渐增强,而shRNASC对食管癌细胞生长无明显影响，见图2a。克隆形成实验显示：与对照组细胞相比，shRNAH2细胞克隆形成率明显受到抑制（P<0.01）, 而shRNASC细胞差异无统计学意义，见图2b。    2.3  shRNAH2对食管癌细胞周期和凋亡的影响    流式结果显示shRNAH2细胞S期降低, 明显阻滞于G2/M期，与对照组比（P<0.05）,而shRNASC无明显变化，见图3a。当经过8Gy射线照射后继续培养24 h，shRNAH2组细胞凋亡率为(55.6±5.52)%，对照组为(14.7±2.55)%，shRNASC组为(15.9±3.75)%，shRNAH2组凋亡率较对照组增加了3.8倍(P<0.01)，而shRNASC组与对照组间相比差异无统计学意义，见图3b。    2.4  shRNAH2对食管癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用    ShRNAH2组肿瘤生长显著慢于对照组（P<0.01）, 而shRNASC组则与对照组无明显差异，见图4a。shRNAH2组瘤体重量也显著低于对照组, 肿瘤生长抑制率达66%（P<0.01），而shRNASC组无明显变化，见图4b。3  讨论    为了探讨Ku80在食管癌中的作用，我们成功构建了shRNAKu80表达载体，挑选出有效的靶序列抑制了内源性Ku80蛋白的表达。结果发现shRNA沉默Ku80蛋白在体外显著抑制食管癌细胞的增殖，同时也抑制了体内裸鼠移植瘤生长。这一结果与Zhuang等[4]用siRNA干扰Ku80蛋白表达抑制子宫颈癌细胞增殖所得的结果相似。然而与Uegaki等[5]研究Ku80失活不影响人体细胞的生长相矛盾。Ku80蛋白沉默抑制细胞增殖可能的机制是：（1）细胞周期调控失调促进细胞增殖。本研究结果显示Ku80蛋白沉默使细胞周期逃逸G1期，而阻滞于G2/M期，细胞增殖受到抑制。在正常情况下，Ku80的功能主要发生于G0、G1及早S期，以参与NHEJ途径修复双链断裂[6]。当Ku80基因沉默后，降低了其与DNA末端的结合和修复能力，使细胞逃过G1、S期进入G2/M期。同时，细胞内其他修复途径发挥作用如同源重组细胞内其他修复途径发挥作用如同源重组，使细胞阻滞于G2/M期，抑制细胞的增殖。（2）逃避细胞凋亡机制，促进细胞增殖。本研究显示Ku80蛋白沉默后促进射线诱导的细胞凋亡，从而使细胞增殖受抑制。（3）Ku80与维持端粒结构稳定性密切相关，且与端粒酶的活性正相关[7]。当Ku80蛋白受抑制后，可降低端粒酶的活性，使端粒末端逐渐缩短，促进细胞衰老和凋亡。（4）Ku80作为转录因子的调控者，其可调控HER2、NFkB、EGFR、P50基因转录，这些基因均促进细胞的增殖[8]。关于Ku80蛋白沉默抑制细胞增殖的具体机制还有待于进一步研究。    总之，shRNA使Ku80蛋白沉默抑制食管癌细胞的增殖和裸鼠移植瘤的生长，同时使细胞周期阻滞于G2/M期，促进细胞凋亡可能成为癌症治疗的一种方法，为今后以Ku80为靶点的基因治疗提供实验依据。【参考文献】［1］ Mimori T, Akizuki M, Yamagata H, et al. 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