流式细胞术检测食管癌细胞DNA含量的临床意义
发表时间：2009-06-24 浏览次数：612次
作者：凌雨田 许沈华 朱赤红作者单位：310022 浙江省肿瘤研究所《 【摘要】 目的 了解食管癌细胞DNA指数（DI）、S期细胞百分率(SPF)、细胞增殖指数(PI)的临床意义。方法 应用流式细胞仪检测64例食管癌手术标本的癌细胞和距癌远端食管切缘粘膜细胞DI、SPF、PI值，并结合随访资料进行临床病理分析。结果 根据DI值，研究对象分为二倍体组(0.90～1.10），亚二倍体组(1.11～1.20）和异倍体组(>1.20)，分别占53.1%(34/64), 21.9%(14/64),25.0%(16/34)。异倍体癌细胞DI、SPF、PI值高于二倍体组（P<0.01）。食管癌异倍体组I～II期病例占18.8%(3/16), 低于二倍体组52.9%（18/34）（P<0.05）。食管癌异倍体组无淋巴结转移病例占25.0%(4/16), 低于二倍体组55.9%（19/34）（P<0.05）。异倍体组与亚二倍体组同时SPF>10%的患者中无淋巴结转移例数占29.4%(5/17),低于二倍体组无淋巴结转移例数52.9%（18/34），有统计学差异（P<0.05）。 结论 食管癌细胞DI值与临床分期、淋巴结转移密切相关。与食管癌患者生存无显著相关，同时癌细胞的SPF值与淋巴结转移密切相关。 【关键词】 食管癌 DNA指数 S期细胞百分率 存活率 FCM 【Abstract】 Objective To investigate the clinical significance of DNA index(DI), S-phase fraction(SPF), cell proliferation index(PI) in esophageal carcinoma cells. Methods DNA content analysis by FCM was performed in cancer cells and mucosal cells in distal surgical margin isolated from 64 operative tissue samples to determine the DI,SPF, PI values in esophageal carcinoma cells , informations on followup were combined to make a clinical pathological ananlysis. Results Reserach subjects were divided into three groups according to DI value: diploid group (DI :0.90～1.10) , hypodilpoid or near diploid group (DI:1.11～1.20), heteroploid group (DI>1.20), accounting for 53.1% (34/64), 21.9%(14/64), 25.0%(16/34) separately. Di ,SPF, PI value of heteroploid cancer cells were significantly higher than those of diploid cancer cells, P<0.01. Heteroploid esophageal carcinoma patients with stage I～II were in 18.8%(3/16), significantly lower than that in diploid patients,52.9% (18/34), P<0.05. Heteroploid esophageal carcinoma patients without lymph node metastasis were 25.0%(4/16), significantly lower than that in diploid patients,55.9%(19/34),P<0.05. Heteroploid esophageal carcinoma patients without lymph node metastasis ,harboring more than 10% SPF were 29.4%(5/17), siginificantly lower than that in diploid patients, 55.9%(19/34), P<0.05. However, no significant difference was found between non-diploid esophageal carcinoma patients without lymph node metastasis ,with lower thant 10% SPF and diploid patients. No significant differences were found camparing hypodiploid or near diploid cancer cells with diploid or heteroploid cancer cells . No significant relationship of DNA content with survial of esophageal carcainoma patients was found. No Correalation between PI value and clinical pathological factors was found. Conclusions DNA content of esophageal carcinoma cells is colsely related to staging , lymph node metastasis and is not significantly related to survival . SPF value is closed related to lymph node metastasis.
【Key Words】 esophagesl carcinoma DNA index DNA content S-phase fraction flow cytometry(FCM)
食管癌是我国高发恶性肿瘤之一，其预后差，病死率高，严重威胁人类生命健康。应用流式细胞术（FCM）来检测肿瘤细胞DI、SPF、PI为临床提供诊断、疗效评价，预后评估在国内外已被广泛接受。但目前国内检测食管癌细胞DI、SPF、PI报道不多［１～３］。作者用FCM检测64例食管癌细胞DI、SPF、PI值，并结合随访资料进行临床病理分析如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 取1998年12月至2000年9月在浙江省肿瘤医院胸外科住院的食管癌病人手术标本，应用FCM检测64例食管癌组织和距癌远端切缘正常食管粘膜细胞DI、SPF、PI值。男51例，女13例；年龄39～72岁。肿瘤部位：食管中上段8例、中段28例、中下段28例；肿瘤大体类型为溃疡型：29例，髓质型：30例，其他型5例；肿块大小：≤3cm 10例、3～6cm 37例、≥6cm 17例；病理类型：高分化15例，中分化42例，低分化7例；有淋巴结转移33例，无淋巴结转移31例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期29例，Ⅲ～Ⅳ期35例。2006年3月1日获得随访资料55例，失访9例。
1.2 试剂 碘化丙啶（PI），美国SIGMA化学公司产品。
1.3 方法 取食管癌和距癌远端切缘食管黏膜,用机械方法分离成单细胞。200目尼龙网过滤，调整细胞数为1×106/ml的单细胞悬液。800r/min离心，去上清液后加PBS 2ml，混匀离心洗涤2次，弃上清液，边震荡边滴入70%乙醇固定，离心，去上清液后，每只试管内加PI染料100μl（50μg/ml），4℃反应30min后过滤，各加0.5ml固定液,上机检测。流式细胞仪(FACS Calibur 美国BD公司)采集窗内10,000个细胞，用Modfit LT 2.0软件分析DNA直方图和细胞周期。
1.4 统计学处理 计量资料采用（x±s）表达，采用SPSS 11.0统计软件对数据分别进行t和χ2检验。
2 结果 不同倍体食管癌细胞DI、SPF、PI比较见表1；食管癌细胞DI指数与淋巴结转移、临床分期及患者生存率的关系见表2；食管癌细胞S期细胞%与淋巴结转移、临床分期及患者生存率的关系见表3。
表1 不同倍体食管癌细胞DI、SPF、PI比较 略
表2 食管癌细胞DI指数与淋巴结转移、临床分期及患者生存率的关系(n，%) 略
表3 食管癌细胞S期细胞%与淋巴结转移、临床分期及患者生存率的关系(n，％) 略
3 讨论
3.1 肿瘤细胞DI与食管癌恶性生物学行为的关系 肿瘤细胞DNA倍性是其生物学特性之一。肿瘤的实质是细胞的异常过度增生，而DNA是肿瘤无限迅速增长的物质基础。细胞增殖旺盛时DNA合成加快含量增高，DI值和SPF的比值的增高决定了肿瘤生物学的恶性行为，所以异常的DNA倍性被认为是肿瘤恶性度的标志。以往大多数研究表明DNA倍体与食管癌淋巴结转移有关，并成为判断预后的一个重要指标，李晓斌等［１］报道异倍体肿瘤有淋巴结转移组DI值（1.90±0.6）比二倍体肿瘤（1.24±0.3）高，两组比较差异有显著意义（P<0.05）。Ueda 等［4］报道异倍体肿瘤常伴有淋巴结受累。NakamuraT［5］报道异倍体常伴有淋巴结转移，预后差，多倍体和异倍体肿瘤常伴有的淋巴管浸润比二倍体多(P<0.01)。原志庆等［3］报道异倍体肿瘤有淋巴结转移率（50%）比二倍体肿瘤（28.6%）高，两组比较差异有显著意义（P<0.05）。本资料显示异倍体组无淋巴结转移（4/16）显著低于二倍体（19/34）组，两组比较差异有显著意义（P<0.05），说明异倍体食管癌细胞增殖更活跃，侵润性更强，更具有容易转移的特性，即使施行了根治手术，术后也应辅以放疗和化疗。提示食管癌DNA含量的分析可估计肿瘤生物学行为、为临床制定治疗方案提供重要参考依据。
目前国内外文献对DNA含量与临床分期关系存有争论。大多数人认为DNA含量与肿瘤的临床分期密切相关。而Hasegawa等［6］发现DNA倍体与组织类型相关而与临床分期无关。本研究结果显示异倍体组I～II期（3/16）显著低于二倍体（18/34）组，两组比较差异有显著意义（P<0.05），也证实食管癌DNA倍体与临床分期具有相关性的。 大多数文献报道DNA倍体与食管癌患者的预后密切相关,如Chanvitan等［7］发现异倍体（DI在1.2～1.8）和多倍体（DI>2.2）的患者生存率降低。Doki等［8］发现异倍体肿瘤伴有较高的组织学分级(P<0.05)和较差的生存率(P<0.01)与二倍体肿瘤比较，可预报食管癌预后。Boettger等［9］显示虽然异倍体肿瘤患者肿瘤切除但生存率没有比未手术的患者好，说明异倍体肿瘤患者预后差。Ueda等［4］用FCM检测52例石蜡包埋食管鳞癌标本DNA，发现异倍体肿瘤与生存率无相关性。Nakamura［5］ 用FCM检测72例食管鳞癌标本 DNA，3年生存率在多倍体、异倍体和二倍体分别为91%,71%,55%，异倍体比二倍体差(P<0.05)，仅异倍体早期食管鳞癌复发。本资料中虽然异倍体组3年存活率均低于二倍体组，但尚未达到统计学意义。
3.2 肿瘤细胞SPF与食管癌恶性生物学行为的关系 在细胞DNA的周期中S期细胞的多少是决定细胞增值水平的重要指标,S期细胞的多少预示着肿瘤的恶性程度，也客观反映了肿瘤细胞增殖的动力学规律，S期细胞与淋巴结转移有明显相关性；李晓斌等［1］ 报道有淋巴结转移组S期细胞百分比明显高于无淋巴结转移组。本资料显示异倍体组与亚二倍体组肿瘤细胞的SPF显著高于二倍体组（P<0.01），异倍体食管癌S期细胞>10%的无淋巴结转移率（29.4%）明显低于二倍体组（55.9%）,两组比较差异有显著意义（P<0.05）,说明异倍体肿瘤细胞增殖活跃，肿瘤侵润、转移进展更迅速。李晓斌等［1］报道S期细胞百分比在I、II、III期之间比较差异有显著意义（P<0.05）。陈献国等［2］报道S期细胞%在食管癌组显著高于阴性对照组。这一点与本资料显示了S期细胞随临床分期的进展而明显增高是相符合的。
3.3 分析与探讨 从本资料来看食管癌细胞DI、SPF、PI与患者的生存率差异无显著性，原因可能是作者采用的是短期生存率计算的缘故，用5年生存率可能会更准确一些，另外标本的数量不够多、取材的局限性都导致了误差的存在，影响了结果的准确性。作者认为应该增大检测标本的数量、多点取材，使标本更具代表性才能得到更精确的DNA数据。应该强调的是本资料显示淋巴结转移与患者预后密切相关，严重影响其生存率，然而食管癌细胞DI、SPF、PI与淋巴结转移具有相关性。本资料显示食管癌细胞的DNA倍性与肿瘤的恶性度、临床分期、转移以及预后密切相关，而与肿瘤的组织分化程度、患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿块大小、血型等无关。癌灶出现异倍体明显的影响了肿瘤的恶性度，有助于了解肿瘤的生物学特性，选择最佳治疗方案。而且异倍体在癌前病变时就有所改变，更加显示了DNA含量在肿瘤发生过程中的重要性与临床意义。DNA含量变化与组织学关系方面尚存在着分歧。这可能与取材部位、病例选择、标本来源与制备有关。为获得更可靠的的结论，必须增大标本量，改善取材方法，标准化制备和检测手段。随着这一技术方法的普及和不断完善，DNA的FCM分析必将在食管癌的研究中得到更广泛的应用。
【参考文献】 1 李晓斌,房定珠,林意,等.食管癌DNA含量和细胞周期分析的临床意义.临床肿瘤学杂志，2003，3(8)：166～168.
2 陈献国，余国伟,郑昭,等. 食管癌脱落细胞DNA增殖活性的研究. 浙江医学2004，26(1)：6～8.
3 原志庆，姜红光，许春雷，等. 食管鳞状细胞癌DNA倍体异质性研究及其临床病理意义. 中华病理学杂志，1996，25（3）：159～161.
4 Ueda M, Yamazaki K, Kubo Y. Clinical and pathological studies on superficial esophageal carcinoma by flow cytometric analysis of nuclear DNA content. Nippon Kyobu Geka Gakkai Zasshi， 1993，41(6):980～985.
5 Nakamura T. Analysis of the malignant potentiality in superficial esophageal carcinoma by cytofluorometry of nuclear DNA and cellular protein contents-in relation to histopathologic findings and prognosis. Nippon Kyobu Geka Gakkai Zasshi， 1992，40(2):242～252.
6 Hasegawa M. Cytodynamic evaluation on the relationship between the mode of intracellular DNA content and the prognosis of esophageal cancer patients. Nippon Geka Gakkai Zasshi，1990，91(2):191～200.
7 Chanvitan A, Nekarda H, Casson AG. Prognostic value of DNA index, S-phase fraction and p53 protein accumulation after surgical resection of esophageal squamous-cell carcinomas in Thailand. Int J Cancer， 1995，63(3):381～386.
8 Doki Y, Shiozaki H, Tahara H, et al. Prognostic value of DNA ploidy in squamous cell carcinoma of esophagus. Analyzed with improved flow cytometric measurement. Cancer， 1993，72(6):1813～1818.
9 Boettger T, Dutkowski P, Kirkpatrick CJ, et al. Prognostic relevance of histomorphological parameters and DNA content and their therapeutic consequences in esophageal carcinoma: a multivariate approach. Hepatogastroenterology， 1998，45(22):994～1004.
