脑胶质瘤患者自体免疫治疗前后Ｔ细胞亚群的变化

作者:董震

【摘要】  目的 探讨脑胶质瘤患者自体免疫治疗的临床应用，观察该治疗对T细胞亚群水平的影响。方法 试验组21例脑胶质瘤患者接受自体树突状细胞免疫治疗，对照组19例接受常规治疗，进行临床随访并检测两组T细胞亚群水平的变化。 结果 试验组中位生存时间（29个月）远大于对照组（10个月），两组生存曲线分布差异有显著性意义（P <0.05）。脑胶质瘤患者外周血中CD3+含量、CD4+含量以及CD4+/CD8+比值明显低于正常对照组(P <0.01)，免疫治疗后患者外周血CD3+、CD4+、CD8+含量以及CD4+/CD8+比值与对照组比较均增加（P <0.05），但CD4+/CD8+比值仍低于健康成人组（P<0.05）。结论 脑胶质瘤存在免疫功能抑制，自体树突状细胞肿瘤疫苗治疗可一定程度重建、增强机体肿瘤免疫应答，抑制脑胶质瘤的复发和进展，从而有效地延长脑胶质瘤患者的生存时间。

【关键词】  脑胶质瘤 树突状细胞 免疫治疗 生存分析 T淋巴细胞亚群

   0  引言

    肿瘤的免疫治疗是近期兴起的、极具应用前景的辅助治疗手段。该方法针对机体肿瘤免疫功能低下的情况，于一个或多个环节增强肿瘤免疫反应，从而抑制肿瘤发展，延长患者生存时间[1]。本研究开展脑胶质瘤自体树突状细胞（dendritic cell， DC）肿瘤疫苗临床试验研究，并检测免疫治疗对患者T淋巴细胞亚群的影响。

    1  资料与方法

    1.1  病例资料  2001年2月～2003年4月期间经病理证实的脑胶质瘤手术患者40 例，随机分为试验组和对照组。试验组21例（男性12例、女性9例，平均年龄39.1岁；星形细胞瘤II 级6例、III 级8例、 IV级7例），对照组19例（男性10例、女性9例，平均年龄38.5岁；星形细胞瘤II 级6例、III 级7例、 IV级6例）。健康体检者12例作为正常对照组（男女各6例，平均年龄37.7岁）。所有脑胶质瘤患者均经同一手术组成员手术治疗，均为术中肉眼全切肿瘤，所有病例均接受常规剂量的放疗，均未接受化疗。

    1.2  自体树突状细胞肿瘤疫苗的制作及治疗方案

    1.2.1  自体树突状细胞肿瘤疫苗的制作  将手术切除的肿瘤标本，不加抗冻剂，立即超低温－85℃保存。1周后复温灭活，制成肿瘤组织匀浆，高速离心(2 000rpm)15分钟，取上清液低温－20℃保存备用。抽取病人外周血50ml，离心法分离出单核细胞层，加入粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）及白细胞介素4（IL4）进行培养。于第2、4、6d向DC培养液中加入GMCSF，并在第2d加入肿瘤组织匀浆上清液与DC共同培养7d，即获得自体DC肿瘤疫苗。

    1.2.2  治疗方案  试验组采用自体树突状细胞肿瘤疫苗治疗方案（肿瘤疫苗静脉输注，其后辅以免疫佐剂卡介苗和20%甘露醇），并于术后7d、１个月、２个月、３个月，按上述方案进行免疫治疗共4次；对照组术后仅接受常规剂量放疗。

    1.2.3  随访及统计分析  所有病例均进行治疗后随访，并应用统计软件（SAS v8）对随访资料进行生存分析。

    1.3  外周血T淋巴细胞亚群检测

    1.3.1  样本采集  试验组和对照组外周静脉血样本采集时间均为术前3d，术后第7d，术后1个月，术后3个月。

    1.3.2  检测方法  清晨空腹采外周静脉血2ml, EDTA抗凝，加入等体积红细胞裂解液,充分混匀，10min后离心（1 500rpm）5min，弃上清。加入PBS液2ml重悬，离心（1 500rpm）5min。加入PBS液并调整制备成浓度为1×106/ml的单细胞悬液。实验采用直接免疫荧光法，取上述悬液100μl，加入CD4 FITC/CD8 RPE/CD3 CyQ三标荧光抗体（IQ Products公司）25μl,振荡混匀，室温避光孵育30min，后PBS液洗涤一次，再加入PBS液1ml，上样检测。流式细胞仪FACScan(Becton Dickinson公司)检测,并用CellQuest软件进行分析，获得各细胞亚群的百分数。

  1．3．3  统计学处理  数据均以±s表示,采用ｔ检验, P<0.05有显著性意义。

    2  结果

    2.1  病例分组临床资料对照分析  统计分析显示三组年龄和性别分布均无显著性差异，试验组与对照组肿瘤病理分级的差异无显著性意义（P>0.05）。

    2.2  生存分析  试验组的中位数生存时间为29个月；对照组的中位数生存时间为10个月。LogRank法检验和Wilcoxon 法检验的结果显示，两组生存曲线分布差异有显著性意义（P<0.05），见图1。

    图1  两组的生存分析曲线

    2.3  外周血T淋巴细胞亚群分析

    2.3.1  健康成人组与脑胶质瘤患者比较

    脑胶质瘤患者CD3+、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+比值明显低于正常对照组(P <0.01)，见表1。表1  健康成人组与脑胶质瘤患者Ｔ细胞亚群比较

    2.3.2  脑胶质瘤患者手术前后比较

    脑胶质瘤患者术前3d和术后7d的T淋巴细胞亚群测定显示：CD4+较术前下降(Ｐ<0.05)，CD4+/CD8+比值下降(Ｐ <0.05)，CD3+与CD8+变化不显著。试验组与对照组术前3d、术后7d的CD3+、CD4+、CD8+含量以及CD4+/CD8+比值差异无显著意义（P >0.05），见表2。表2  试验组与对照组不同时期T细胞亚群比较

    2.3.3  自体树突状细胞免疫治疗对机体内T淋巴细胞亚群的影响

    试验组在术后1月（免疫治疗后3周）和术后3月（免疫治疗后11周）与对照组相比较显示：CD3+、CD4+、CD8+含量以及CD4+/CD8+比值均增加(P<0.05)，而试验组在免疫治疗后11周与免疫治疗后3周的T淋巴细胞亚群相比，CD3+继续上升（P<0.05）,其余各指标差异无显著意义。 试验组在术后1月（免疫治疗后3周）与健康成人组比较，CD8+增加（P<0.05），CD4+/CD8+比值降低（P<0.05）。试验组在术后3月（免疫治疗后11周）CD3+、CD4+、CD8+均增加，CD4+/CD8+比值仍降低（P<0.05），见表2。

    3  讨论

    研究表明恶性肿瘤的发生、发展与机体免疫系统功能状态密切相关，T细胞介导的免疫在机体抗肿瘤反应中发挥重要作用。 T淋巴细胞亚群中CD3+、CD4+、CD8+细胞在活性、数量、比例上的变化与肿瘤的发展、演变及抗肿瘤反应均有密切关系。

    本研究显示脑胶质瘤患者外周血中CD3+、CD4+以及CD4+/CD8+比值明显低于正常对照组，术后CD4+下降，CD4+/CD8+比值进一步减低，均提示脑胶质瘤患者机体的免疫功能受抑制, T淋巴细胞减少、功能不全、各细胞亚群比例失调，导致T淋巴细胞免疫功能低下。因此，提高机体抗肿瘤免疫能力的关键在于制备有效的诱导T细胞主动抗瘤效应的疫苗。

    肿瘤细胞能够逃避免疫应答的主要原因之一是肿瘤细胞的抗原性极弱,而这种极弱的抗原性归咎于MHC抗原表达的减少和共刺激信号的缺乏。树突状细胞是一类具有很强抗原递呈作用的辅佐细胞,可用来增强肿瘤细胞免疫原性[2]。本研究采用的自体树突状细胞肿瘤疫苗属主动性特异性免疫治疗。此方法在体外扩增DC，肿瘤冻融抗原与DC共培养，并回输体内[3]。可一定程度加强肿瘤细胞免疫原性，诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞大量增生，产生对胶质瘤细胞的特异细胞毒作用，外周血循环中的CD8+ T淋巴细胞可显著增加。研究表明树突状细胞与肿瘤细胞的融合疫苗可以在体内有效致敏CD4+和 CD8+ T 淋巴细胞[4]。动物实验表明，经肿瘤细胞冻融裂解物致敏的树突状细胞免疫治疗的荷瘤大鼠生存期明显延长,外周血中CD8+T淋巴细胞比例增加[5]。Yoshida等[6]应用DC肿瘤疫苗治疗19例颅内恶性肿瘤（12例肺癌脑转移，7例高级别星形细胞瘤），并通过51Cr释放和淋巴细胞增殖实验证实了DC肿瘤疫苗可增强T细胞针对同种肿瘤的杀伤并促进T淋巴细胞的增殖。Yu等[7]在DC肿瘤疫苗早期临床试验中发现，免疫治疗后再次手术患者的肿瘤组织中存在细胞毒性T淋巴细胞和记忆型T淋巴细胞。

卡介苗（BCG）为常用的免疫治疗佐剂，是一种有效的生物反应调节剂，具有很强的免疫原性，最早被用于膀胱癌的治疗。BCG能刺激机体免疫系统产生免疫反应，促进淋巴细胞分化、增殖，激活机体的免疫细胞产生细胞因子，发生抗肿瘤效应。BCG能有效地增加外周血CD4+T细胞的数量及功能[8]。本研究结果中CD3+和CD4+的增加可能源于BCG的非特异性抗肿瘤作用。本研究中免疫治疗后CD4+/CD8+比值依然低下，考虑为在肿瘤释放的免疫抑制因子作用下辅助性T细胞和抑制性T细胞的比例失衡所致。

    本研究所采用的自体免疫治疗方法可增强肿瘤抗原提呈，激活肿瘤特异性杀伤细胞，并刺激机体产生非特异性抗肿瘤免疫反应，从而引起外周血T淋巴细胞亚群产生相应变化。自体树突状细胞肿瘤疫苗的作用机理有待深入探讨，其临床应用尚须进一步评估。

【参考文献】  ［1］ 雷霆，牛洪泉，董震，等. 树突状细胞和脑胶质瘤自体免疫治疗的实验和临床研究［J］. 中华神经外科杂志,2004，20（2）：131.

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［５］ 朱新梅，吕传真，肖保国，等. 树突状细胞瘤苗治疗颅内胶质瘤的实验研究［J］. 中国免疫学杂志，2004，20（5）：311314.

［６］ Yoshida S, Morii K, Watanabe M, et al. The generation of anti-tumoral cells using dentritic cells from the peripheral blood of patients with malignant brain tumors［J］. Cancer Immunol Immunother, 2001, 50(6): 321327.

［７］ Yu JS, Wheeler CJ, Zeltzer PM, et al. Vaccination of malignant glioma patients with peptidepulsed dendritic cells elicits systemic cytotoxicity and intracranial Tcell infiltratio[J]. Cancer Res, 2001, 61(3): 842847.

［８］ Bartolome Pacheco MJ, MartinezTaboada VM, Blanco R., et al. Reactive arthritis after BCG immunotherapy: T cell analysis in peripheral blood and synovial fluid［J］. Rheumatology, 2002,41(10): 11191125.