bax基因对人BcaCD885颊癌细胞凋亡的影响

【摘要】  目的 探讨bax基因对人BcaCD885颊癌细胞凋亡的影响。 方法 转染人baxα基因重组质粒及对照质粒于BcaCD885细胞中。 通过HE染色光镜观察对细胞形态学进行检测； 通过TUNEL原位末端标记及流式细胞术对细胞凋亡进行定性、 定量检测。 结果 bax质粒转染组BcaCD885细胞出现凋亡的形态学改变， TUNEL阳性红染凋亡细胞数量增多， 凋亡小体出现， 其细胞凋亡率与空白对照组及对照质粒转染组之间存在极显著差异(P<0.01)。结论 baxα基因重组质粒能促进BcaCD885细胞发生凋亡。

【关键词】  bax基因 BcaCD885细胞 细胞凋亡

　　0  引言    　　细胞凋亡在肿瘤发生、发展及治疗中起重要作用，其发生过程受相关基因的调控。与bcl2促细胞存活的作用相反，bax促细胞凋亡。对某一特定的细胞来说，其对凋亡诱因的反应可能取决于bcl2家族成员的表达及相对浓度水平[1]。本研究采用基因转染技术，用Lipofectamin 2000将baxα基因重组质粒pORFhBaxα导入人颊癌细胞株BcaCD885细胞中，提高bax的表达水平，探讨其能否促进癌细胞凋亡。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料    　　重组人bax基因表达质粒pORFhBaxα(美国InvivoGen公司):含576bp人baxα基因；对照质粒pORFmcs(美国InvivoGen公司)；RPMI 1640培养基(美国GIBCO  BRL公司)；脂质体Lipofectamine 2000（1mg/ml）(美国Invitrogen公司)；TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nickend labelling technique)原位末端标记试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司)；碘化丙啶(Propidium iodide，PI)(美国Sigma公司)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  实验分组  空白对照组：BcaCD885细胞培养24h，三蒸水代替质粒“转染”24h，培养24h；对照质粒转染组：BcaCD885细胞培养24h, pORFmcs质粒转染24h,培养24h；bax质粒转染组：BcaCD885细胞培养24h， pORFhBaxα质粒转染24h，培养24h。

　　1.2.2  细胞培养及转染  BcaCD885细胞于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基、37℃  5%  CO2条件下培养。质粒转染采用脂质体Lipofectamine 2000参照产品说明进行。

　　1.2.3  细胞形态学检测  常规HE染色，光镜观察。

　　1.2.4  TUNEL原位末端标记细胞凋亡检测  培养细胞弃培养液，4%多聚甲醛固定，40μg/ml的蛋白酶K 37℃消化30min，0.3% TritonX100 (含3％羊血清)通透液4℃处理20min，10% BSA封闭液室温处理30min，TUNEL反应混合液(1液2μl，2液18μl)37℃孵90min，抗荧光素抗体，37℃孵60min，室温下快红显色20min，光镜下观察。细胞核红染为阳性凋亡细胞。以PBS代替TUNEL反应混合液为阴性对照。

　　1.2.5  流式细胞术细胞凋亡率检测  收获细胞，75%冷乙醇固定，加PI至终浓度为50μg/ml，4℃避光30min，Coulter公司Elite ESP型流式细胞仪检测细胞DNA含量，以G0/G1峰前亚二倍群为凋亡峰，计算凋亡率。

　　1.3  统计学分析    　　所得数据采用SPSS10.0进行分析。

　　2  结果

　　2.1  HE染色细胞形态学检测结果   　　　　空白对照组及对照质粒转染组BcaCD885细胞密集生长，形态完整，呈圆形、多角形、大小不一，核浆比例倒置，呈恶性改变。bax质粒转染组见大部分细胞核仁消失，核染色致密浓缩，核裂解，胞膜完整，呈现凋亡的形态学改变，见图1～3。

　　2.2  TUNEL原位末端标记细胞凋亡检测结果

　空白对照组及对照质粒转染组随机观察5个高倍视野，每高倍视野仅见个别或无凋亡细胞。同法观察bax质粒转染组，每高倍视野见5～8个凋亡细胞，并见凋亡小体出现，见图4～6。

　　2.3  流式细胞术细胞凋亡率检测结果    　　空白对照组及对照质粒转染组细胞凋亡率分别为（1.03±0.15）%及（2.38±1.49）%。bax质粒转染组凋亡细胞占（15.93±3.04）%。LSD 检验，bax质粒转染组细胞凋亡率与空白对照组及对照质粒转染组存在极显著差异(P<0.01)，而空白对照组与对照质粒转染组凋亡率无差异(P>0.05)。

　　图1  空白对照组BcaCD885细胞 (HE×250)（略）

　　图2  对照质粒转染组BcaCD885细胞(HE×250)（略）

　　图3  bax质粒转染组BcaCD885细胞 (HE×250)（略）

　　图4  空白对照组BcaCD885细胞 (TUNEL×250)（略）

　　图5  对照质粒转染组BcaCD885细胞  (TUNEL×250)（略）

　　图6  bax质粒转染组BcaCD885细胞  (TUNEL×250)（略）

　　3  讨论    　　细胞凋亡过程受凋亡相关基因的调控，其中bcl2基因家族倍受关注。根据其功能可分为两类：促进细胞生存组和促进细胞凋亡组。与bcl2促细胞存活作用相反，bax促细胞死亡[2]。在上颌窦鳞状细胞癌中，bax高表达与高凋亡率及预后良好有关[3]。bax的高表达能明显提高化疗药物及放疗杀伤肿瘤细胞的敏感性[4，5]。本研究中，我们利用质脂体Lipofectamin 2000转染人Baxα基因重组质粒pORFhBaxα及对照质粒pORFmcs于人颊癌细胞株BcaCD885细胞中，用HE染色、TUNEL原位末端标记、流式细胞仪等技术对各组瘤细胞凋亡情况进行检测。结果发现： pORFhBaxα能促进BcaCD885细胞凋亡的发生。bax可能通过以下途径调节BcaCD885细胞凋亡的发生：提高bax蛋白的表达可能使得其同源二聚体形成增多，促进颊癌细胞凋亡的发生；bax的过表达可能阻止促生存蛋白对Caspase的活化抑制，提高了Caspase的活性，催化核内的 DNase抑制蛋白 ICAD 的裂解，而激活核酸内切酶（Endonuclease）CAD，从而提高BcaCD885细胞的凋亡率；高表达bax蛋白可能通过升高细胞器膜通透性，促进Ca2+外流，提高BcaCD885细胞的凋亡率；bax蛋白高表达或同源二聚体形成能促进线粒体通透性转变或在线粒体外膜上打孔，诱发细胞凋亡；bax还迁移到核膜上及核内，核膜bax水平的上升与核蛋白的降解呈正相关，在本研究中，我们也观察到BcaCD885颊癌细胞凋亡时，癌细胞的胞核内bax的表达明显升高；bax还能与其他基因蛋白如p53相互作用，调节细胞凋亡[1，68]。    　　bax基因通过多种途径调节细胞凋亡的发生。在本研究中,我们从基因入手，提高BcaCD885细胞内bax基因的表达水平，促进BcaCD885细胞凋亡的发生，为利用bax基因治疗颊癌提供了实验基础和理论依据。

【参考文献】  　　［1］ Gallo G, Giarnieri E, Bosco S, et al. Aberrant bcl2 and bax protein expression related to chemotherapy response in neuroblastoma[J]. Anticancer Res, 2003, 23(1B): 777784.

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