光动力疗法对人乳腺癌细胞MDAMB231凋亡的影响

【摘要】  目的 探讨光动力疗法(PDT)对人乳腺癌细胞凋亡的影响。方法 以人乳腺癌细胞株MDAMB231为研究对象，以血卟啉衍生物(HpD)为光敏剂，以630nm波长激光为光源，采用连续照射的方式。将不同浓度HpD染色的MDAMB231细胞，照射不同剂量的激光后，用MTT法测定其A492值，选择最佳作用参数；电镜观察PDT作用后不同时间的细胞凋亡情况，并采用免疫组化方法检测促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl2的表达情况。结果 随着PDT作用后时间的延长，细胞凋亡现象越明显；Bax蛋白表达无明显变化(P>0.05)，而Bcl2蛋白表达自PDT后6h起显著下降(P<0.01)，PDT后6h Bax/Bcl2比值依次递增，且有统计学意义(P<0.05)。结论 光动力疗法可诱导人乳腺癌细胞发生凋亡，其机制可能与Bax和Bcl2蛋白表达的比值有关。

【关键词】  光动力疗法；乳腺肿瘤；细胞凋亡

　　Effect of photodynamic therapy on apoptosis in human　breast cancer cell line MDAMB231

　　Cai Jun, Ye Qingqing, Yang Jiyuan, Li Jingjing, Zhou Zhongxiao, Huang Zhuozheng, Liu Jianlun

　　(Oncosis Department, the First Affiliated Hospital of Yangtze River University,Jingzhou 434000; Oncosis Department, the Affiliated Tumor Hispital of Guangxi Medical Universaty, Nanning 530007, China)

　　ABSTRACT: Objective  To study the effect of photodynamic therapy (PDT) on apoptosis in human breast cancer line MDAMB231. Methods  The cells were incubated with a photosensitizer (hemoporphyrin derivative, HpD) with different concentrations, and then were irradiated for 10min using the successive laser of different dosages at 630nm. Cell viability was measured with MTT, and cell apoptosis was identified morphologically by electron microscope. Expressions of Bax and Bcl2 proteins were detected by immunocytochemistry. Results  Cell apoptosis became more obvious as time prolonged after PDT. No alteration in the expression of Bax was observed at the different times after PDT (P>0.05). However, the expression of Bcl2 was significantly decreased 6h after PDT (P<0.01), and the ratio of Bax/Bcl2 expression was markedly increased as time prolonged after PDT(P<0.05). Conclusion  Photodynamic therapy can induce cell apoptosis of human breast cancer cells, and the mechanism may be associated with the ratio of Bax/Bcl2 expressions.

　　KEY WORDS: photodynamic therapy; breast cancer; cell apoptosis

　　细胞凋亡又称程序化死亡，常在胚胎发育、激素调节、免疫反应及某些物化刺激中发生。已有大量实验证实，Bax和Bcl2蛋白表达在细胞的凋亡中起着关键的作用[12]。光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)对人乳腺癌细胞MDAMB231凋亡的影响文献报道鲜见。本研究通过观察PDT对人乳腺癌细胞凋亡的影响，进一步探讨PDT凋亡的作用机制，为PDT在乳腺癌中的应用提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  光敏剂及光源  血卟啉衍生物(hematoporphrphyrin derivative, ＨpD)针剂：100mg/20mL，重庆华鼎药业公司出品，产品批号：030902。630 PDT治疗仪，重庆雷高公司出品，波长630nm，输出功率≥2000mW。

　1.2  细胞培养  人乳腺癌细胞株MDAMB231由中山大学医学院引进，细胞培养技术参照司徒镇强等[3]介绍的方法进行。MDAMB231细胞常规在RPMI 1640[含10%(体积分数)灭活的新生小牛血清、青霉素100u/mL、链霉素100mg/mL]中培养。置于37℃、5%(体积分数)CO2孵箱中，饱和湿度。细胞培养密度为1×105-2×105/mL，每3-4d传代1次，取对数生长期细胞接种用于实验(免疫组织化学加盖玻片)。

　　1.3  实验分组及PDT处理  实验分为如下4组：实验组(光敏剂＋照光)；光敏剂量对照组(单纯加光敏剂)；激光对照组(单纯照光)；空白对照组(不加光敏剂，不照光)。

　　1.4  MTT法测定MDAMB231细胞的吸光度值(A492 )  细胞经消化后，取一滴细胞悬液于血球计数板上计数，调细胞密度为1×105/mL，取100μL接种于96孔培养板至细胞培养箱中培养24h。细胞贴壁后，将HpD用RPMI1640完全培养基分别稀释到实验所需的质量浓度：0、0.5、1、2、4mg/L。光照剂量为：0、1、5、10J/cm2，照射面积为29.26cm2，光斑直径为6cm，光照时间为10min。为了方便照射，每板只接受一种激光剂量，每组均设有5个复孔。细胞接种24h后弃去旧培养基，每孔加入不同浓度的HpD的完全培养基200μL，严格避光培养8h，使细胞对HpD的吸收达饱和。予不同剂量的激光照射后立即更换新鲜的RPMI 1640完全培养基200μL，继续培养24h，每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，继续避光培养3h后终止培养。小心吸取孔内培养基，每孔加入100μL的DMSO，恒温振荡10min。用酶标仪检测各组A492值，用一空白孔调零。

　　1.5  形态学观察  根据MTT选择的最佳作用参数，PDT后3、6、12、24、48h消化细胞，移入离心管中加PBS(0.01mol/L，pH7.2)，吹打离心(1000r/min，10min)，置于戊二醛溶液中固定，系列脱水、包埋、修块、半薄切片、定位、超薄切片、染色，透射电子显微镜(H500，日立公司，日本)观察并照片。

　　1.6  免疫组化法检测MDAMB231细胞的Bax和Bcl2蛋白表达  实验步骤按即用型第二代免疫组化ElivisionTM Plus光普试剂盒方法并稍加修改。根据已选的最佳参数，PDT后3、6、12、24、48h，从6孔培养板中取出盖玻片，光学高倍显微镜(×100)下观察，Bax和Bcl2胞膜和胞浆染色棕黄色为阳性，每张片随机观察3个视野(每视野100个细胞)，每样品取5张片的平均值为最后的阳性细胞百分率。

　　1.7  统计学处理  应用SPSS 10.0统计软件，采用重复测量的方差分析，以P<0.05为差异有统计学差异。

　　2  结果

　　2.1  MDAMB231细胞的吸光度值(A492)  在相同的HpD浓度下，A492随着光照剂量的增大而减小；在相同的激光剂量照射下，A492亦随着光敏剂的浓度增大而减小；单纯照光和单纯加光敏剂的A492变化不大。细胞杀伤率=(对照组A492-实验组A492)/对照组A492 ×100%。HpD的质量浓度为0.5mg/L和光照能量为1J/cm2时基本无杀伤作用，但光照能量超过5J/cm2、HpD超过2mg/L时PDT效应增加不明显。因此HpD质量浓度为2mg/L、光照剂量为5J/cm2是本实验的最佳作用参数(表1)。

　　表1  不同浓度HpD、不同光照能量PDT对MDAMB231细胞A492值的影响（略）

　　Table 1  Effect of MDAMB231 A492 after PDT in different HpD concentration and laser energy by MTT assay

　　△P<0.01 vs. same concentration of HpD in controls; *P<0.01 vs. same dosage of PDT in controls

　　2.2  PDT作用后MDAMB231细胞的凋亡情况  透射电镜可见，对照组细胞呈典型的肿瘤细胞特征，核大，内有核仁，核浆比大，有核分裂相。实验组从PDT后12h起，细胞胞核体积减小，细胞结构不清，线粒体明显肿胀，在部分细胞可见细胞质内有大量空泡形成，细胞内出现胞质浓缩、核固缩、裂解及凋亡小体形成等凋亡特征性变化(图1)。

　2.3  MDAMB231细胞的Bax、Bcl2蛋白表达  Bax阳性表达可见细胞胞浆或胞膜呈棕黄色。对照组阳性细胞表达率为(79.00±3.16)%，PDT后各组(3、6、12、24、48h)阳性细胞率分别为：(81.20±5.12)%、(71.60±5.03)%、(80.20±3.96)%、(80.60±4.62)%、(79.40±6.66)%，组间两两比较均无显著性差异。Bcl2阳性表达亦可见细胞胞浆或胞膜呈棕黄色。PDT后3h与对照组Bcl2阳性细胞表达率接近，无明显统计学差异，自PDT后6h起Bcl2随PDT后时间的延长，其阳性表达率递减，而Bax/Bcl2比值递增，且有统计学意义(P<0.05，表2)。

　　图1  实验组的凋亡细胞（略）

　　Fig.1 Apoptotic cell (×4000)

　　A: chromatin condensed crescentshaped and nuclear membrane; B: nucleole disappeared in earlier period of apoptosis, compact chromatin agglutinated along nuclear membrane

　　表2  HpDPDT作用后不同时间MDAMB231细胞的Bcl2表达及Bax/Bcl2的比较（略）

　　Table 2  Expression of Bcl2 and Bax/Bcl2 after HpDPDT on MDAMB231 at different time

　　*P<0.01, **P<0.05 vs. control group

　　3  讨论    　　细胞凋亡受阻是恶性肿瘤无限制生长的重要原因之一，诱导细胞凋亡为人类攻克肿瘤提供了一个新的途径。在肿瘤光动力治疗过程中，光敏剂经光照射后产生大量活性氧物质(ROS)，是诱导细胞死亡的重要原因，而细胞死亡有凋亡和坏死两种形式。研究表明，PDT可诱导肿瘤细胞凋亡，也可引起肿瘤细胞坏死。但是目前仍无一种统一的机制来解释这种现象[4]。    　　本研究中用的MTT法是一种检测细胞存活和生长的常用方法，A值的大小间接反映了活细胞的数量。本实验观察到，A492值随着HpD浓度和照光剂量的增加而降低，单纯照光和单纯加光敏剂组A492变化不明显。HpD为0.5mg/L和光照能量为1J/cm2时A492值变化不大，但光照能量超过5J/cm2、HpD超过2mg/L时，A492递减不明显，PDT效应达平台期，说明此时再增加光敏剂浓度和光照剂量无益PDT疗效提高。因此，HpD 2mg/L、光照能量5J/cm2为最佳实验参数。    　　本研究电镜观察结果显示，HpDPDT后12h起，可见细胞胞核减小，细胞结构不清，部分细胞细胞质内有大量空泡形成，线粒体明显肿胀，细胞内出现胞质浓缩、核固缩、裂解、凋亡小体形成等凋亡特征性变化。从组织形态上看，光动力疗法可显著诱导人乳腺癌细胞凋亡。    　　本研究免疫组化结果显示，Bax蛋白在对照组和实验组其阳性细胞表达率均在80%左右，表达无统计学差异，提示HpDPDT光动力作用对人乳腺癌细胞MDAMB231 Bax蛋白的表达无影响。这点与Usuda等[6]的报道不同。HpDPDT光动力作用后6h起人乳腺癌细胞MDAMB231 Bcl2蛋白水平显著低于对照组(P<0.05)，表明HpDPDT光动力作用降低了人乳腺癌细胞MDAMB231 Bcl2蛋白的表达水平。目前的研究表明，对于线粒体为靶点的光敏剂而言，线粒体膜蛋白氨基酸是主要的光化学反应中心之一[5]。当蓄积于线粒体的光敏剂在适当的波长的激光激发下，产生大量的活性氧物质，与线粒体膜蛋白中的氨基酸残基发生作用，使蛋白上的氨基酸被氧化，蛋白质内部及分子间产生异常交联，使膜蛋白合成障碍。因此，认为HpD在激光的激发下产生活性氧造成的线粒体氧化，可能是导致线粒体膜蛋白的Bcl2蛋白水平降低的重要原因。Bcl2与Bax是凋亡调节功能相反的的两种蛋白，一般认为是通过形成同源二聚体或者是异源二聚体共同发挥凋亡的调节作用[1,7]。本研究的结果表明，HpDPDT后6h Bax/Bcl2的比值明显高于对照组，且成时间依赖性(P<0.05)。提示随着光动力作用后时间的延长，HpDPDT上调了人乳腺癌细胞MDAMB231 Bax/Bcl2的比值，致使MDAMB231 Bax蛋白水平相对较高，越来越多的Bax与Bax形成Bax－Bax同源二聚体，促成凋亡的发生。因此，可以推测，PDT诱导细胞凋亡的发生是通过降低胞内Bcl2的水平，来上调Bax/Bcl2的比值来实现的，Bax/Bcl2的比值是决定细胞生存或是凋亡的关键因素。

【参考文献】  　　[1]Adams JM, Cory S. The Bcl2 protein family: arbiters of cell survival [J]. Science, 1998, 281(5381):13221326.

　　[2]Gupta S, Dwarakanath BS, Muralidhar K, et al. Role of apoptosis in photodynamic sensitivity of human tumor cell lines [J]. Indian J Exp Biol, 2003, 41(1):3340.

　　[3]司徒镇强，吴军正. 细胞培养 [M]. 西安：西安世界图书公司, 1996:5888.

　　[4]Wyld L, Reed MW, Brown NJ. Differential cell death response to photodynamic therapy is dependent on dose and cell type [J]. Br J Cancer, 2001, 84(10):13841386.

　　[5]Xue LY, Chiu SM, Oleinik NL. Photochemical destruction of the Bcl2 oncoprotein during photodynamic therapy with the phthalocyanine photosensitizer PC4 [J]. Oncogene, 2001, 20(26):34203427.

　　[6]Usuda J, Chiu SM, Azizuddin K, et al. Promotion of photodynamic therapyinduced apoptosis by the mitochondrial protein Smac/DIABLO: dependence on Bax [J]. Photochem Photobiol, 2002, 76(2):217223.

　　[7]Brenner C, Cadiou H, Vieira HL, et al. Bcl2 and Bax regulate the channel activity of the mitochondrial adenine nucleotide translocator [J]. Oncogene, 2000, 19(3):329336.