兔腹主动脉粥样硬化支架植入后血管壁及内膜改变

　　作者：许文克，高传玉 作者单位：郑州大学第一附属医院心内科，郑州 450052

　　【摘要】 目的 通过建立兔腹主动脉粥样硬化植入支架动物模型，探讨支架植入后血管壁和内膜变化及发生机制。方法 采用兔腹主动脉内膜剥脱术加含1.5%高胆固醇的高脂饮食来建立动脉粥样硬化动物模型，并在此基础上建立兔粥样硬化腹主动脉植入支架模型，并通过组织病理学检查，来揭示支架植入后血管壁和内膜组织形态学变化和病变的发生机制。结果 在动脉粥样的动物模型基础上所建立兔腹主动脉粥样硬化植入支架动物模型，经组织形态学和免疫组化检查显示：动物模型目标血管段管腔内膜明显增厚、血管出现不同程度的狭窄，新生内膜中有大量增殖细胞核抗原(PCNA)高表达(着色强度IS：5.268±0.475)的血管平滑肌细胞(VSMC)和泡沫细胞及细胞外基质(ECM)。经计算机图像分析仪测定其组织形态学指标分别为残余管腔面积[(9.67±0.18)mm2]、最大内膜厚度[(1.33±0.05)mm]、内膜面积[(5.78±0.23)mm2]和狭窄程度[(31.02±1.91)%]。结论 本实验成功地建立了兔腹主动脉粥样硬化植入支架动物模型，并认为支架术后血管新生内膜中VSMC过度增殖是导致支架植入后管腔内膜明显增厚的可能原因。

　　【关键词】 冠心病,动脉粥样硬化,支架,血管内膜

　　Abstract：Objective To establish an atherosclerotic abdominal aorta restenosis model after stenting in rabbits and to study the mechanism of restenosis. Methods Atherosclerotic rabbit models were made by denudating abdominal aortic intima and constantly feeding high lipid diet (cholesterol concentration: 1.5%); then stents were implanted into atherosclerotic abdominal aorta. Histomorphologic changes of the arterial wall after stenting were shown by histomorphologic and immunohistochemical examination. Results Abdominal aortic wall was markedly thickened and stenosis of the aortic cavity was found. Aortic intima composed of high proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expressing (IS：5.268±0.475) smooth muscle cells (SMCs), foam cells and extracellular matrix. Thickness of neointima was(1.33±0.05)mm; area of neointima was(5.78±0.23)mm2; stenosis degree was(31.02±1.91)%; and area of residual lumen was(9.67±0.18)mm2. Conclusions SMCs’ proliferation in the neointima could induce the thickening of arterial wall after stenting.

　　Key words： Coronary atherosclerosis heart disease; Atherosclerosis; Stent; Neointima

　　经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention, PCI)是在临床上广泛应用治疗冠心病的重要方法。随着对复杂血管病变、多支血管病变和小血管病变的PCI 治疗,术后血管再狭窄发生率约20%～40%[ 1，2 ]，限制了该技术的应用和发展，使预防血管再狭窄成为医学领域中亟待解决的重要课题。在探索PCI术后再狭窄机制和防治的研究中，动脉粥样硬化血管植入支架动物模型的建立是必不可少的环节。由于涉及支架植入后血管病变影响因素众多[3]，此方面研究在很大程度上依赖于建立动脉粥样硬化植入支架动物模型。本研究在已建立的兔腹主动脉粥样硬化的狭窄动物模型的基础上，来制备更接近临床的兔腹主动脉粥样硬化植入支架动物模型，并通过对血管组织病理学检查，来揭示支架植入后血管壁和内膜组织形态学变化和病变的发生机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　雄性新西兰大白兔30只，购自河南省实验动物中心(合格证号:医动字第4102009号)，体重2.5～3.5 kg, 4个月龄。分为实验组(n=15)、对照组(n=15)。全价颗粒饲料由河南省实验动物中心提供，配制成含1.5%胆固醇的高脂饮食饲料。

　　1.2 实验器材与试剂

　　Coridis 公司的普通球囊导管(3.0～3.5)mm×15 mm、0.014″mm×195 cm ATW 指引钢丝和球囊扩张压力泵等。Boston 公司的NIR 冠状动脉内支架(3.0～3.5)mm×(10～25)mm，美国GE 公司的VIVID7彩色超声电脑声像仪、LCplus 心血管造影机等;武汉博士德生物试剂公司即用型增殖细胞核抗原单克隆抗体，常规HE染色剂，PBS缓冲液，DAB(二氨基联苯胺)显色剂。4%多聚甲醛等。

　　1.3 腹主动脉粥样硬化动物模型制备

　　对实验组动物行腹主动脉下段血管内皮剥脱术，参照Schneide等[3]的方法，并加以改良，术后给予12周的高脂饮食。对照组给予全价颗粒饲料至实验结束。

　　1.4 腹主动脉粥样硬化动物模型评估

　　对术后实验组动物经12周的高脂饮食饲养，再行腹主动脉超声检查。二维超声观察血管走向、管腔内径、管壁厚度、有无斑块等情况，测量直径狭窄百分比。经超声检查观察血管狭窄程度≥50%的视为模型制备成功。

　　1.5 腹主动脉粥样硬化植入支架动物模型

　　一旦超声判断有明显的动脉粥样硬化斑块形成，实验组开始服用阿司匹林片25 mg/d,氯吡格雷12.5 mg/d。 3 d后分别行支架植入术。直视下以21 G穿刺针行股动脉穿刺术。穿刺成功后，借助于导丝，植入5 F动脉鞘，拔出导丝及扩张器。在X线透视下经右股动脉注射优维显370约3～10 ml行选择性腹主动脉造影。通过ANCOR计算机心血管图像分析系统测定邻近参照血管内径，狭窄段管腔最小内径，狭窄长度，狭窄程度。造影完毕后撤出。经鞘管送入0.014英寸导引钢丝至左骼动脉，将裸支架预先捏紧于PTCA球囊上，动脉球囊直径比为1.0∶1.3,沿导引钢丝将带支架球囊送至动脉狭窄的部位，通过压力泵向球囊内注入肝素生理盐水，球囊扩张压力10～14 ATM，持续20 s，支架扩张后，球囊抽成负压，导管退出。所有动物在支架植入后15 min重复造影，证实管腔通畅，无充盈缺损、管壁夹层、栓塞、支架移位或远端动脉痉挛。术后结扎股动脉，缝合伤口，并常规肌肉注射青霉素3 d，每日480万U，术中自股动脉注入肝素200 IU/kg。待动物清醒后送回笼中继续高脂饮食喂养至30 d。

　　1.6 取材

　　术后30 d，所有动物经耳缘静脉注气20～40 ml处死动物，取出腹主动脉含支架的血管段(对照组取出腹主动脉下段的血管)，用生理盐水反复加压灌洗血管腔内无血细胞后，用眼科剪纵行剪开含支架的血管段，仔细剥离支架，把支架与内中膜分离开来，立即植入液氮中保存备用。

　　1.7 组织处理

　　将切取的腹主动脉标本石蜡包埋，分别做HE染色，在光学显微镜下，采用HPIAS 1000病理图文分析系统来观察与分析实验组动物相应血管进行组织形态学变化。采用免疫组化SP染色法，并采用Bresalier半定量公式判断染色结果[4]来检测它们的细胞增殖相关指标增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的水平变化。

　　1.8 统计学处理

　　数据采用统计软件SPSS10.0进行分析。结果以均数±标准差(±s)表示。两组间比较采用组间t或t’检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 动脉粥样硬化动物模型腹主动脉彩色超声检查结果

　　15只正常饮食兔腹主动脉的下段：血管内膜回声规整，未见有斑块形成。内皮剥脱术后第12周彩色超声检查15只实验组动物腹主动脉狭窄部位血管内膜回声不均，可见多个高回声斑块突向血管腔，血管腔明显狭窄,在血管的狭窄程度、参照血管内径、血管狭窄段最小内径分别为(56.89±1.05)%、(2.940±0.032)mm、(1.267±0.032)mm。

　　2.2 腹主动脉粥样硬化植入支架动物模型的组织形态学变化

　　(1)对照组HE染色见血管壁由单层排列整齐匀称的内皮细胞覆盖，管壁完整;中膜层较厚，中膜中有8～12层环形排列规则、整齐的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)(图1)。内膜、中膜和外膜分界清楚，内弹力板和外弹力板清晰、完整。(2)实验组兔腹主动脉支架段内的血管有不同程度的增生性反应，表现为血管管腔有较厚新生内膜形成，厚度不均，主要由平滑肌细胞、泡沫细胞和胶原纤维构成，平滑肌细胞排列紊乱，形态不一。内弹力板附近梭形核的VSMC有增多的表现，排列紊乱，中间有少量炎性细胞。金属支架网丝基本均匀分布于血管内膜下，管腔狭窄明显，无内皮细胞，部分内弹力板断裂，血管中层与外膜未见其他明显变化(图2)。经计算机图像分析仪测定其组织形态学指标与对照组相比有明显差异(表1)，提示实验组动物的含支架部位腹主动脉的管壁均出现新生内膜的增生，其中均有增殖的VSMC、泡沫细胞和细胞外基质。 表1 两组实验动物腹主动脉管壁和内膜的比较(注：与对照组比较， aP<0.05，bP<0.001

　　2.3 免疫组化结果

　　(1)对照组管壁中VSMC的胞核PCNA 蛋白无表达，胞核无着色(图3);(2)实验组兔腹主动脉含支架的血管内可见在内膜中大量VSMC胞核内PCNA 蛋白高度表达(图4)，着染胞核大部分呈棕黄色，少部分呈棕褐色(着色强度IS：5.268±0.475)，且内膜中大量增殖的VSMC排列、分布杂乱，可见泡沫细胞以及大量基质组织。3 讨论

　　支架植入后血管病变是多因素造成的一个复杂的过程，目前常用来建立动脉粥样硬化模型的动物有大鼠、犬及兔等[5]，还没有一个动物模型能模拟支架植入后血管病变过程中的所有因素。因此，建立尽可能模拟与人类冠状动脉支架后血管病变生物形态相似的动物模型是研究支架后血管病变的重要条件。新西兰兔广泛用于实验性血管病变的研究，实验研究表明建立兔腹动脉可较好模拟人的冠状动脉[5，6]。内皮损伤和脂质浸润是动脉粥样硬化病变产生的最根本原因，制备的动脉粥样硬化的动物模型应具备两个基本条件：内皮损伤和高脂饮食。本实验采用兔高脂饮食结合动脉内皮剥脱术的方法，制备腹主动脉下段的动脉粥样硬化动物模型。此动脉狭窄的制备方法与Conte等[7] 的报道类似，加以改良后，在方法学上更为简单，重复性较好，便于操作。结果经彩超检查证实复制出比较满意的动脉粥样硬化动物模型，为进一步研究血管支架术后动物模型的制备奠定基础。

　　研究表明[8]，血管内膜增殖是血管损伤后修复的普遍反应，在支架术后血管病变的发生中更起着决定性的作用。新生内膜增殖这种复杂的生物反应多发生在术后3～6个月内,其增生反应的组织学特征为:增生组织主要为平滑肌细胞和细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)[9]。Indolfi等[10]的研究表明，血管的病变与VSMC增生所致的血管新生内膜增生关系密切;而与血管重塑未发现或无明显的相关性。本实验建立动脉粥样硬化植入支架动物模型，并观察到模型中含支架段血管壁均出现不同程度新生内膜的增生，表现为血管内膜明显增厚、新生内膜面积增大与血管出现不同程度的狭窄。其中均有增殖的VSMC、泡沫细胞和ECM。

　　PCNA是一种仅在增殖细胞中合成与表达的一种相对分子量为36 000多肽，又称细胞周期蛋白，作为DNA聚合酶δ的辅助蛋白，直接参与DNA的合成，其量的变化与DNA合成一致[11]。本实验以PCNA作为评价VSMC增殖的指标,并观察到:正常VSMC的胞核中PCNA无表达;而在建立动脉粥样硬化植入支架动物模型腹主动脉管壁的新生内膜VSMC的胞核中PCNA的表达均有明显升高。

　　本实验在复制出较满意的动脉粥样硬化动物模型基础上，建立了尽可能模拟与人类冠状动脉支架后血管病变的生物形态相似的动物模型。并通过组织形态学和免疫组化检查证实支架术后血管新生内膜中VSMC过度增生是导致血管病变的可能原因。因此，通过建立动脉粥样硬化植入支架动物模型，不仅为我们探讨动脉粥样硬化血管支架植入后血管病变的发生机制提供了一个良好的实验平台，同时也进一步研究抑制此类血管病变发生的干预方法奠定了基础。

　　【参考文献】

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　　[5]Muller DW，Ellis SG, Topol EJ.Exprimental models of coronary artery restenosis[J].J Am Coll Cardiol,1992,19:418432.

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　　[7]Conte MS,Van Meter GA,Akst LM,et al. Endothelial cell seeding influenclesion development following arterial injury in the cholesterolfed rabbit[J].Cardio Vasc Res,2002, 53:5350153511.

　　[8]Mark JP, Bart JGL de Smet, Yvonne van der H, et al. Arterial remodeling after balloon angioplasty or stenting in an atherosclerotic experimental model[J] . Circulation,1997, 96: 9961003.

　　[9]Ornowski R, Hong MK, Fermin OT, et al.Instent restenosis:contributions of inflammatory responses and arterial injury to neointima hyperplasia[J].J Am Coll Cardiol, 1998, 31: 224230.

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