动脉粥样硬化斑块内FIZZ1表达促进平滑肌细胞清道夫受体A上调

　　作者：张红明，李晓燕，何作云 作者单位：济南军区总医院心内科，山东 济南 250031

　　【摘要】 目的 探讨ApoE基因敲除鼠动脉粥样硬化斑块内FIZZ1表达情况及其对平滑肌细胞清道夫受体A(SRA)表达的影响。方法 C57BL/6J ApoE基因敲除鼠及C57BL/6J野生型小鼠各9只，分别喂养高脂饲料及普通饲料，24周后处死小鼠，石蜡包埋血管后做连续切片，行HE染色及FIZZ1免疫组化。用氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)以及终浓度分别为3×10-6mmol/L、 9×10-6mmol/L、 2.7×10-5mmol/L的FIZZ1刺激培养的平滑肌细胞，激光共聚焦显微镜确认SRA表达后，流式细胞术检测FIZZ1对oxLDL诱导的平滑肌细胞SRA表达的影响。结果 ApoE基因敲除鼠高脂饲养24周后，主动脉根部明显形成动脉粥样硬化，可见FIZZ1在动脉粥样硬化斑块内明显表达，同龄野生型C57BL/6J鼠正常血管壁内，未见FIZZ1表达，重组FIZZ1能明显促进oxLDL诱导的平滑肌细胞SRA表达(与对照组比较，P<0.01)。结论 C57BL/6J野生型小鼠正常血管不表达FIZZ1, C57BL/6J ApoE基因敲除鼠动脉粥样斑块表达FIZZ1，FIZZ1促进oxLDL诱导的平滑肌细胞SRA表达，提示FIZZ1可能在ApoE基因敲除鼠动脉粥样硬化进展中起一定的促进作用。

　　【关键词】 动脉粥样硬化,FIZZ1,清道夫受体A

　　Abstract：Objective To explore the expression of FIZZ1 in atherosclerotic plaque of ApoE/ mouse and the effect of FIZZ1 on Scavenger receptor A (SRA) expression in vascular smooth muscle cells (VSMCs). Methods Nine C57BL/6J ApoE/ mice fed with high fat diet and 9 C57BL/6J mice fed with normal diet were investigated. 24 weeks later，all the mice were euthanized and aortas were collected. HE staining and FIZZ1 immunohistochemistry were performed on the aortic tissue after paraffin embedding. VSMCs were treated with oxLDL (20mg/L) plus recombinante FIZZ1 at different final concentration (3×10-6mmol/L, 9×10-6mmol/L, 2.7×10-5mmol/L). SRA expression in VSMCs was detected by flow cytometry and laser confocal microscopy. Results After 24 weeks of high fat diet treatment, large atherosclerotic plaque was found formed at ApoE/ mouse aortic root. FIZZ1 was found in atherosclerotic plaque of ApoE/ mice by immunohistochemistry. Recombinant FIZZ1 enhanced oxLDL induced SRA expression in VSMCs (FIZZ1 groups vs. control group, all P<0.01). Conclusions FIZZ1 was found in atherosclerotic plaque of C57BL/6J ApoE/ mice while no FIZZ1 was expressed in normal aorta of C57BL/6J wild type mice. Recombinant FIZZ1 enhanced oxLDL induced SRA expression in VSMCs, which indicates the involvement of FIZZ1 in the development of atherosclerosis in C57BL/6J ApoE/ mice.

　　Key words： Atherosclerosis; Found in inflammatory zone 1; Scavenger receptor A

　　FIZZ1(Found in Inflammatory Zone 1)是2000年新发现的一个与炎症相关的缺氧诱导有丝分裂因子,相对分子量9400，具有刺激肺动脉平滑肌细胞增殖、收缩血管、促进血管新生，刺激肌纤维母细胞分化等功能[13]，在脂肪组织的间质血管以及选择性激活的巨噬细胞中均有表达，缺氧的肺血管壁也有表达。由于动脉粥样硬化斑块内存在IL4等Th2型细胞因子以及大量激活的巨噬细胞[4]，动脉粥样硬化的血管壁也存在缺氧，因此，我们推测在动脉粥样硬化斑块内可能有FIZZ1表达，本文用免疫组织化学方法检测动脉粥样硬化斑块内FIZZ1表达并探讨其对氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)刺激的血管平滑肌细胞清道夫受体A(SRA)表达的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物来源和主要试剂、仪器

　　9只C57BL/6J ApoE基因敲除(ApoE/)鼠, 20～40 g，4周龄;9只C57BL/6J野生型小鼠，20～40 g，4周龄，均由北京大学实验动物中心提供。兔抗鼠FIZZ1(RELMalpha)抗体(英国abcam公司)，本辣根过氧化物酶(HRP)山羊抗兔IgG( 北京中杉金桥生物技术公司)，羊抗鼠SRA多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，重组FIZZ1 (美国Santa Cruz公司), oxLDL，(中国协和医科大学)，莱卡荧光倒置显微镜(德国LEIKA)，流式细胞仪(美国FAC Star)。

　　1.2 实验操作及检测指标

　　(1) 动脉粥样硬化C57BL/6J ApoE基因敲除小鼠9只，在实验条件下经1周适应喂养后，予高脂饲料(2%胆固醇、0.4%胆酸盐、10.0%脂肪、其余为普通饲料);(2)9只野生型C57BL/6J小鼠喂食普通饲料，至第24周末，处死小鼠，用生理盐水逆行灌注主动脉后，自主动脉根部至腹主动脉离断整个血管，取胸主动脉行HE染色及其他各项指标检测。

　　1.3 切片制作

　　将各组小鼠主动脉自主动脉根部至腹主动脉末端离断，近心端1 cm切下 ,制备石蜡切片, 每组连续横切20张,取4张切片行HE染色,其余切片常规脱蜡后，行FIZZ1免疫组化,每张切片滴加1∶300兔抗鼠FIZZ1抗体，阴性对照组不加一抗， PBS清洗标本3次，加入1∶300 HRP山羊抗兔IgG，孵育30 min，PBS清洗标本,DAB显色5 min，棕黄色颗粒为阳性表达。

　　1.4 血管平滑肌细胞(VSMC)分离与培养

　　VSMC培养采用组织贴块法,无菌条件下C57BL/6J鼠的胸主动脉, 按常规方法培养平滑肌细胞，将VSMC以2×106细胞/ml接种至6孔板, 培养24 h后换用无血清培养基静止24 h, 然后分别给以下各组刺激: (1)对照组,用等量生理盐水刺激培养的细胞;(2) oxLDL 刺激组：用终浓度oxLDL 20 mg/L刺激培养细胞;(3)3～5组为药物处理组：oxLDL 20 mg/L刺激培养细胞后，用终浓度分别为3×10-6mmol/L, 9×10-6mmol/L, 2.7×10-5mmol/L重组FIZZ1刺激培养的平滑肌细胞。

　　1.5 SRA表达检测

　　将oxLDL刺激24 h的平滑肌细胞，进行荧光免疫组化激光共聚焦检查，观察平滑肌细胞SRA表达情况。收集各组细胞用甲醛固定15 min，0.5%TritoneX100孵育20 min，血清封闭20 min，加入1∶100羊抗鼠SRA抗体，37℃孵育2 h，加入1∶200 FITC兔抗羊IgG抗体, DAPI 10 mg/L染核10 min，Leica TCSSP5激光共聚焦显微镜下观察SRA表达，预置激发光波长488 nm,发射光波长522 nm。激光共聚焦显微镜确认SRA表达后，收集oxLDL刺激24 h的平滑肌细胞，用流式细胞仪检测平滑肌细胞SRA表达。各组细胞用甲醛固定15 min，血清封闭20 min，加入1∶100羊抗鼠SRA抗体，空白对照组不加一抗，加等量PBS， 37℃孵育2 h，PBS清洗标本3次，加入1∶100 FITC兔抗羊IgG抗体, 轻轻吹打混匀，孵育30 min，PBS清洗标本3次, 于流式细胞仪上样检测，以背景对照为基础计算阳性细胞率，每次实验每组设6个复孔，重复3次。

　　1.6 统计学处理

　　计量资料用均数±标准差(±s)表示,采用SPSS 11.0统计软件包，以oneway ANOVA分析各组之间的差异，各组两两比较用q检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 FIZZ1在动脉粥样硬化斑块表达情况

　　ApoE基因敲除鼠高脂饲养24周后，出现明显的动脉粥样硬化，动脉粥样硬化斑块内可见泡沫细胞聚集，免疫组化可见斑块内有明显棕黄色颗粒(图1)，而C57BL/6J野生型小鼠血管壁内，未见FIZZ1阳性表达(图2)。

　　2.2 oxLDL刺激平滑肌细胞SRA表达

　　如图3所示，激光共聚焦显微镜可见染核剂DAPI将细胞核染成蓝色，绿色荧光代表SRA阳性表达，oxLDL刺激24 h的平滑肌细胞，有SRA表达，主要位于细胞膜，生理盐水刺激的平滑肌细胞，未见SRA表达。

　　2.3 FIZZ1对平滑肌细胞SRA表达影响

　　oxLDL刺激组与对照组SRA表达阳性率比较, 差异有统计学意义(P<0.01)，表明oxLDL能刺激的平滑肌细胞SRA表达;FIZZ1 3×10-6mmol/L组与oxLDL刺激组比较，差异有统计学意义(P<0.01);FIZZ1 9×10-6mmol/L 组与FIZZ1 3×10-6mmol/L组比较,差异有统计学意义(P<0.05); FIZZ1 2.7×10-5mmol/L组与9×10-6mmol/L组SRA表达阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.01)，表明FIZZ1能明显促进oxLDL诱导的平滑肌细胞SRA上调。3 讨论

　　FIZZ1是2000年新发现的一个与炎症相关的缺氧诱导有丝分裂因子，为抵抗素分子家族成员之一，它有111个氨基酸残基, 29%的氨基酸序列与抵抗素相同，在FIZZ1基因组序列的5′、3′侧翼区以及内含子中发现了核因子κB(NFκB)、增强子结合蛋白(C/EBP)、信号转导和转录激活因子6(STAT6)等多个炎症相关转录因子的结合位点，提示FIZZ1表达可能受到这些转录因子的调节[5]。目前仅在小鼠,大鼠脂肪组织的间质血管部分以及选择性激活的巨噬细胞里表达，原来在人体发现的FIZZ1又被重新命名为FIZZ2, 人体与鼠FIZZ1对应的基因仍在探索之中。

　　研究表明，FIZZ1具有刺激肺动脉平滑肌细胞增殖、收缩血管、促进血管新生和刺激肌纤维母细胞分化等功能 [2,6]，FIZZ1在肺纤维化、哮喘、缺氧、矽肺等疾病的致病机制中具有重要意义[13], 然而，其是否在动脉粥样硬化斑块内表达，目前国内外均无报道，我们基于下述理由认为动脉粥样硬化斑块中可能存在FIZZ1表达：(1) 动脉粥样硬化时，大量处于活化状态的巨噬细胞积聚于粥样斑块及周围组织，Th2型细胞因子IL4、IL13可以刺激巨噬细胞表达FIZZ1，且在粥样硬化斑块中存在[4];(2)Teng等[6]研究表明,在缺氧条件下，肺血管壁内FIZZ1表达明显上调，而动脉粥样硬化的动脉壁内存在缺氧[7];(3) 在慢性炎症及寄生虫等感染时，FIZZ1在激活的巨噬细胞以及肉芽组织中能表达[8]，一些研究者在动脉粥样硬化的斑块中找到肺炎衣原体等病原体，因此，在慢性炎症的粥样斑块内FIZZ1可能存在。本实验研究表明，在动脉粥样硬化的斑块内明显可见FIZZ1阳性颗粒，证实了FIZZ1在动脉粥样硬化斑块内表达。

　　从鼠的动脉粥样硬化模型研究中发现了两种在AS泡沫细胞形成和血管病变中起重要作用的受体: A类清道夫受体和B类清道夫受体CD36，SRA 是一种三聚体形式的膜糖蛋白，由一个半胱氨酸连接的二聚体和一个非共价结合的单体组成，SRA 同AS的关联性首次在SRA 基因敲除小鼠中发现，SRA 缺失小鼠的腹膜巨噬细胞对乙酰化低密度脂蛋白 (acLDL)和oxLDL 的降解分别降低了80%和30%以上，表明巨噬细胞通过SRA 清除修饰低密度脂蛋白(mLDL)。体内外研究均表明，由SRA 介导的巨噬细胞，平滑肌细胞对mLDL的内吞不受胞内胆固醇水平的负反馈调节，使得胞内脂质无限制积聚，形成泡沫细胞，是治疗动脉粥样硬化新的靶点之一[9]。 由于Teng等[6]发现FIZZ1在3×10-6mmol/L～3×10-5mmol/L剂量范围内对平滑肌具有明显促增殖作用，本研究使用该浓度范围刺激平滑肌细胞，发现FIZZ1能明显促进oxLDL诱导的平滑肌细胞SRA表达，平滑肌细胞SRA上调，有可能使细胞脂质吞噬增加，促进肌源性泡沫细胞形成，从而促进动脉粥样硬化进展。

　　最近研究发现，FIZZ1还具有刺激内皮细胞分泌黏附分子血管细胞黏附分子1 (VCAM1) 和VEGF(血管内皮生长因子)表达的功能[10], VCAM1在血管异常表达能损坏血管内皮细胞，促进动脉粥样硬化进展[11]，VEGF能刺激血管新生，促进斑块破裂，因此，FIZZ1很可能在动脉粥样硬化进展中发挥多种综合作用，与动脉粥样硬化进展的关系值得进一步深入研究。

　　【参考文献】

　　[1]Holcomb IN, Kabakoff RC, Chan B,et al. FIZZ1, a novel cysteinerich secreted protein associated with pulmonary inflammation, defines a new gene family[J].EMBO，2000,19:40464052.

　　[2]Steppan CM, Brown EJ, Wright CM, et al .A family of tissuespecific resistinlike molecules[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2001,98:502506.

　　[3]Beltowski J. Adiponectin and resistinnew hormones of white adipose tissue[J]. Med Sci Monit，2003,9:5561.

　　[4]冯宗忱.动脉粥样硬化血管壁的慢性炎症[J].中华心血管病杂志，2005,33：393394.

　　[5]Stutz AM, Pickart LA, Trifilieff A，et al.The Th2 cell cytokines IL4 and IL13 regulate found in inflammatory zone1/resistinlike molecule alpha gene expression by a STAT6 and CCAAT/enhancerbindingproteindependent mechanism[J]. J Immunol，2003，170:17891796.

　　[6]Teng X, Li D, Champion HC, Johns RA. FIZZ1/RELMalpha, a novel hypoxiainduced mitogenic factor in lung with vasoconstrictive and angiogenic properties[J].Circ Res，2003,92:10651067.

　　[7]T Bjornheden, M Levin, M Evaldsson, et al. Evidence of hypoxic areas within the arterial wall in vivo[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol.1999，19:870876.

　　[8]Donnelly S, O’ Neill SM, Sekiya M, et al.Thioredoxin peroxidase secreted by Fasciola hepatica induces the alternative activation of macrophages[J]. Infect Immun，2005，73:166173.

　　[9]Kamada N, Kodama T, Suzuki H. et a1.Macrophage scavenger receptor (SRA Ⅰ/Ⅱ) deficiency reduced dietinduced atherosclerosis in C57BL/6J mice[J]. J Atheroscler Thromb，2001，8:16.

　　[10]Tong Q, Zheng L, Lin L, et al. Hypoxiainduced mitogenic factor promotes vascular adhesion molecule1 expression via the PI3K/AktNF{kappa}B signaling pathway[J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2006，35:444456.

　　[11]邓靖宇,时 德,綦晓龙. NFkappa B在动脉粥样硬化中的作用[J].高血压杂志,2003,11：6163.