培哚普利和缬沙坦对兔动脉粥样硬化脑组织核转录因子κB,诱导型一氧化氮合酶表达的影响

　　作者：武晓菊，鹿育萨 作者单位：山西医科大学，太原 030001

　　【摘要】 目的 建立兔高胆固醇动脉粥样硬化模型，观察脑组织核转录因子κB(NFκB) 和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的阳性表达，探讨培哚普利、缬沙坦的干预效果及临床意义。方法 30只雄性新西兰大白兔,随机分为4组:正常对照组 (A组); 高脂饮食组(B组);高脂饮食加培哚普利组(C组);高脂饮食加缬沙坦组(D组); 喂饲8周后, 取脑组织标本用免疫组化方法(SABC法)测定NFκB的表达;分光光度法测定脑组织iNOS的活力。结果与对照组相比,高脂饮食组脑组织中NFκB，iNOS水平明显升高(P<0.05);高脂饮食加培哚普利组及高脂饮食加缬沙坦组NFκB，iNOS 水平明显降低(P<0.05),但仍显著高于对照组(P<0.05)。结论 动脉粥样硬化致脑组织中NFκB, iNOS 表达发生的变化,与肾素血管紧张素系统(RAS)的激活有关, 培哚普利和缬沙坦从不同水平阻断RAS后,可减轻NFκB,iNOS的表达,达到保护脑组织的作用。

　　【关键词】 动脉粥样硬化,脑组织,肾素血管紧张素系统; 脑组织核转录因子κB; 诱导型一氧化氮合酶

　　Abstract：Objective To study the effects of Perindopril and Valsartan on expression of nuclear factor kappa B (NFκB), inducible nitric oxide synthase(iNOS)in brain tissue of atherosclerotic rabbit. Methods Thirty male New Zealand white rabbits were divided into four groups randomly: Normal control (Group A); high cholesterol diet (Group B); high cholesterol diet and Perindopril (Group C); high cholesterol diet and Valsartan (Group D). After eight weeks, the expression of NFκB in brain tissue was examined by immunohistochemistry and the activity of iNOS was measured by chemical colorimetry assay. Results Compared to control group, levels of NFκB and iNOS in AS group were both significantly increased (P<0.05). Levels of NFκB and iNOS in Perindopril and Valsartan group were significantly lower than in AS group(P<0.05), but were higher than that in control Group (P<0.05). Conclusions NFκB and iNOS expression changes in brain tissue of atherosclerotic rabbit may associate with rennin angiotensin system (RAS) activation. Perindopril and Valsartan could interrupt RAS activation, decrease NFκB and iNOS expression and may mitigate brain injury.

　　Key words： Atherosclerosis; brain tissue; Rennin angiotensin system; Nuclear factor kappa B; Inducible nitric oxide synthase

　　动脉粥样硬化(AS)所致的心脑血管疾病是目前危害人类健康的首要疾病。以往关于AS的研究主要集中于主动脉和冠状动脉等大中动脉，对AS引起的脑损伤的研究相对欠缺。有报道,用高胆固醇食物喂养家兔,诱导AS形成的同时,也导致了微循环及脑组织功能与形态学的损害[1]。故本实验建立兔动脉粥样硬化模型，观察脑组织形态学的改变及血管紧张素Ⅱ(angiotensin, AngⅡ)，核转录因子κB (nuclear factor kappa B, NFκB)和诱导型 一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表达情况，观测培哚普利和缬沙坦的干预作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验药物、试剂和仪器

　　培哚普利系施维雅(天津)制药有限公司产品;缬沙坦系北京诺华制药有限公司产品; 胆固醇由成都科龙化工试剂厂生产;兔抗AngⅡ、兔抗NFκB多克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司;iNOS 检测试剂盒购自南京建成生物医学工程研究所;Mias2000图像分析系统由四川川大智胜软件股份有限公司生产。

　　1.2 动物分组与喂养

　　32只健康雄性新西兰白兔在山西医科大学动物实验中心由专人单笼饲养，进食量 100 g·只-1·d-1，自由饮水，每周更换垫料1次，适应1周后进入实验。随机分为4组：(A 组)正常对照组(n=6),(B 组)高脂饮食组(n=8)，(C 组)高脂饮食加培哚普利(0.5 mg·kg-1·d-1)组(n=8)，(D 组)高脂饮食加缬沙坦(10 mg·kg-1·d-1)组(n=8)。对照组用基础饲料，高脂饮食组除基础饲料外每天加1.5%胆固醇，其他两组在高脂饮食的基础上按照体重给与相应的药物。各组共喂饲8周。

　　2 检测指标和方法

　　2.1 血脂检测

　　于8周末在清醒状态下经兔中央动脉取空腹血标本(禁食12 h )，离心(3000 r/min ，10 min)，留取血清-20℃冻存。在BackmaanLX20全自动生化分析仪上成批测定血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、及低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDLC)的浓度。

　　2.2 病理形态学观察

　　第8周末，用空气栓塞的方法将动物处死，开颅迅速取出部分脑组织及颈动脉, 用冷等渗盐水充分洗净血液,滤纸吸干，留取部分颈动脉进行肉眼形态学观察;留取部分脑组织，置于10%的中性福尔马林溶液中浸泡固定48 h ，常规酒精脱水，石蜡包埋，3 μm厚度连续切片，做脑组织HE染色及AngⅡ，NF κB免疫组化染色;余新鲜脑组织置于-70℃冰箱保存备用。

　　2.3 脑组织免疫组化染色

　　采用SABC法检测脑组织中AngⅡ、NFκB的表达, 具体步骤按说明书进行。实验以PBS代替一抗做阴性对照, NFκB 活化表现为胞质、胞核黄染,以核黄染为阳性细胞, AngⅡ以细胞膜和细胞质黄染为阳性，否则为阴性,采用Mias2000图像分析系统, 计算阳性单位值(positive unit, PU),每张切片随机选择3个视野,求其平均值。

　　2.4 分光光度法测定脑组织iNOS的活力

　　取脑组织0.1 g加9倍生理盐水制备成10%组织匀浆，3000 r/min ，离心10 min ，取上清液，具体按试剂盒说明书进行，结果以吸光度值表示。

　　2.5 统计学处理

　　采用SPSS11.5统计软件,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较用单因素方差分析和SNKq检验,两组比较用两样本t检验， P<0.05认为差异有统计学意义。

　　3 结果

　　3.1 8周后血脂检测结果

　　高脂饮食组、培哚普利组和缬沙坦组的TC及LDLC水平较对照组显著升高(P<0.05)，但这3组间差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。 表1 兔血清TC、LDLC水平比较注：与A组比较， aP< 0. 05

　　3.2 病理学改变

　　肉眼可见正常对照组颈动脉内膜光滑，无斑块形成。高脂饮食组颈动脉内膜粗糙，凹凸不平，大量黄白色斑块突出于管腔表面，并连接成片，高脂饮食加培哚普利组和高脂饮食加缬沙坦组可见散在的白色斑块突出于管腔表面，主要集中在血管开口处，除颈动脉近端外较少连接成片。光镜检查高脂饮食组见灶性脑组织内大量泡沫细胞聚集,似为早期软化灶, 脑组织中炎性细胞浸润。

　　3.3 各指标的变化

　　3.3.1 免疫组化法检测各组AngⅡ，NFκB的表达(图1，2 ) 正常对照组只表达少量的AngⅡ(5.24±1.25)，NFκB(6.90±1.64)，高脂饮食组与正常对照组比较，AngⅡ(17.07±2.7 vs. 5.24 ±1.25, P<0.05)，NFκB(22.24±2.62 vs. 6.90±1.64, P<0.05) 阳性单位均显著提高; 培哚普利组与高脂饮食组比较NFκB阳性单位显著降低(12.64±1.39 vs. 22.24±2.62，P<0.05) ，但是仍然高于正常对照组(12.64±1.39 vs.6.90±1.64，P<0.05);缬沙坦组与高脂饮食组比较NFκB阳性单位显著降低(14.34±2.30 vs. 22.24±2.62，P<0.05)，但是仍然高于正常对照组(14.34±2.30 vs.6.90±1.64，P<0.05);培哚普利组与高脂饮食组比较AngⅡ阳性单位显著降低(12.40±1.44 vs. 17.07±2.7，P<0.05)，但高脂饮食加缬沙坦组与高脂饮食组比较AngⅡ阳性单位差异无统计学意义(17.24±1.51 vs. 17.07±2.7，P>0.05)。

　　3.3.2 各组iNOS的活力(比色法) 高脂饮食组与正常对照组比较iNOS的活力显著提高(9.99±0.86 vs. 3.37±0.35，P<0.05);培哚普利组与高脂饮食组比较iNOS的活力显著降低(5.55± 0.53 vs. 9.99±0.86, P<0.05);但是仍然高于正常对照组(5.55± 0.53 vs. 3.37±0.35, P<0.05);缬沙坦组与高脂饮食组比较iNOS的活力显著降低(5.51 ±0.65 vs. 9.99±0.86, P<0.05)，但是仍然高于正常对照组(5.51 ±0.65 vs. 3.37±0.35, P<0.05)。4 讨论

　　AS 所致的心脑血管疾病的发病率、致死率在各种疾病中位居前列。 有报道证实 ，在发生AS 的血管，RAAS 被激活，血管紧张素Ⅱ通过其1型受体加重了脏器损害[2]。近年的研究发现RAAS可引起脑水肿,加重缺血性脑组织的损害[3]。然而在AS后其对脑损伤的影响报道较少。本实验中，病理学改变表明AS已形成且对脑组织有损伤。有研究显示血胆固醇和炎症标记物均增高，预示着心脑血管病的危险，而单纯的胆固醇增高只预示着心血管病，与脑卒中没有重要关系[4]，故积极探索抗AS炎症的途径对有效的AS治疗及预防脑血管疾病有重要意义。

　　高胆固醇血症可通过激活RAS 使自由基产生增加而诱导NFκB 活化。NF κB 活化是机体效应细胞大量释放促炎细胞因子，导致组织炎症反应过度和组织损伤的关键环节。NFκB激活后可促进iNOS 等表达产生自由基，产生的自由基反过来又可激活NFκB，从而形成正反馈，使反应不断扩大，AS发展过程中iNOS 的表达有一定的阶段性,反映体内的炎性程度,影响AS发展[5] 。另有研究发现,肾素血管紧张素可通过多种途径引起氧化应激并参与动脉粥样硬化的发生[6]，NFκB 可能是AngⅡ活化与氧化应激反应之间的重要纽带。

　　近年有相关报道ACEI、ARB 类的药物除了降压作用外还可通过抑制NFκB 减少CRP 的分泌, 使AS所致的心脑血管事件的危险性下降[7]。

　　本实验结果显示，高脂饮食组脑组织AngⅡ，NFκB 的阳性表达及iNOS的活力显著高于对照组， 高脂饮食加培哚普利组 AngⅡ阳性表达较高脂饮食组明显降低，高脂饮食加缬沙坦组的 AngⅡ水平与高脂饮食组相比无明显差异;高脂饮食加培哚普利及高脂饮食加缬沙坦组较高脂饮食组NFκB，iNOS明显降低，与有关文献报道一致，两药能通过抑制RAS，减少自由基生成，防止NFκB活化,从多途径发挥抗AS作用。动物实验也发现ACEI及ARB均有抗AS作用。

　　本研究表明AS可导致脑功能形态改变，培哚普利和缬沙坦通过拮抗RAS 的致炎和氧化应激作用，及调节NFκB、iNOS的表达，有脑组织保护的作用。对临床上患有AS，及其有高胆固醇血症的患者应用ACEI或血管紧张素受体拮抗剂可能具有比较重要的意义。

　　【参考文献】

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