CIK细胞对乳腺癌细胞株抗增殖及诱导凋亡的作用

【摘要】  目的 研究多种细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokineinduced kill cells,CIK)对 ZK751乳腺癌细胞株的抗增殖和诱导凋亡作用，并探讨其作用机制。方法 应用MTT法检测CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞株的抗增殖作用的影响及细胞毒活性；通过倒置显微镜、HE染色、透射电镜观察凋亡细胞的形态学改变。结果 MTT比色法表明随着CIK细胞与乳腺癌细胞效靶比增加及作用时间延长，抑制率明显增强（P<0.01）。CIK细胞作用于乳腺癌细胞24h后，形态学观察乳腺癌细胞发生凋亡或坏死。结论 CIK细胞是一种新型高效具有较强杀伤体外乳腺癌细胞的免疫活性细胞。

【关键词】  CIK细胞 ZK751乳腺癌细胞 抗肿瘤 细胞凋亡

　　0  引言    　　从80年代Rosenberg等观察到在患非免疫系统肿瘤的动物中给予重组白细胞介素2（IL2）， 动物的淋巴细胞可以调节肿瘤的消退和转移以来， 细胞免疫治疗就迅速扩展开来， 人们先后研究了淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞， 肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞，  CD3单抗激活的杀伤(CD3AK)细胞，  但是由于细胞来源困难、 细胞扩增倍数低或者细胞毒力不高等原因，  上述细胞的临床应用受到极大限制。 为此， 美国斯坦福大学医学院骨髓移植研究中心1991年首先报道了具有高增殖能力和高细胞毒性的多种细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokineinduced kill cells,  CIK)细胞[1]。 目前， 国内尚未见应用CIK细胞体外诱导肿瘤细胞凋亡的形态学观察和机制探讨。 本课题通过光镜、 电镜观察了CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞株作用的形态学变化。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  药品及试剂  基因重组人IL2、鼠抗人CD3McAb、淋巴细胞分离液、基因重组人IFNγ、RPMI Medium 1640培养基、IMDM培养基、胎牛血清、MTT。

　　1.1.2  肿瘤细胞  ZK751乳腺癌细胞株由西安医科大学肿瘤研究所提供，由本科室体外传代培养。

　　1.2  方法

　　1.2.1  效应细胞制备  取健康者的成分白细胞用淋巴细胞分离液（比重为1.077±0.001）经Ficoll密度梯度离心法（density gradient centrifugation）提取单个核细胞（PBMC），此细胞被重悬并保存于IMDM 培养液中（含10％  FCS）。调至１×10６个/ml，第0d加入IFNγ 2 000u/ml，PHA 100μg/ml放置37℃、5%  CO2细胞培养箱中培养24h，第1d加CD3 McAb  5μg/ml,重组人IL2 1 000u/ml,继续培养。每3d半量换液，同时补加IL2  1 000u/ml，PHA 100μg/ml调细胞浓度至１×10６个/ml，第14d收获细胞。

　　1.2.2  MTT法测量细胞存活率  取对数生长期乳腺癌细胞0.4％台盼蓝染色及计数，调整浓度至1×105个/ml细胞悬液为靶细胞，取培养14d的CIK细胞调整浓度为１×10６个/ml为效应细胞。按10∶1、20∶1、30∶1的效靶比混合加入96孔板，另设单独效应细胞组（效应细胞＋培养液）及单独靶细胞组为阴性对照组（ 靶细胞＋培养液）、每组重复8孔，置于37℃、5％  CO2细胞培养箱中培养24h、48h后取出，每孔加MTT  20μl(5mg/ml),继续培养4h后小心弃去上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）160μl,轻轻振荡10min后用酶联免疫检测仪λ＝490nm测吸光度（A）值，杀伤率计算公式为：抑制率（%）＝[１－(实验孔A值－效应孔A值)/靶细胞孔A值]×100%

　　1.2.3  倒置显微镜观察  将CIK细胞和靶细胞以效靶比30∶1接种于24孔培养板内，置于37℃、5％  CO2细胞培养箱中培养，随时在倒置显微镜下观察。设对照组为单纯培养的乳腺癌细胞。

　1.2.4  HE染色观察  将CIK细胞和靶细胞以效靶比30∶1接种于已放置支持物小盖片的12孔培养板内。对照组：加等量生理盐水。连续培养24h后取出小盖片。将小盖片用4％多聚甲醛固定30min后，水洗3min，苏木素2min，水洗3min，0.5％盐酸酒精8s，水洗15min，90％乙醇5min，伊红30s，脱水、透明及封固。

　　1.2.5  透射电镜观察  将CIK细胞和靶细胞以效靶比30∶1混合的4、 12及24h细胞离心， 弃去上清液， 剩下的细胞团用2.5%戊二醛固定、 梯度丙酮脱水;  Epon812混合树脂包埋;  超薄切片机切片;  醋酸钠和柠檬酸铅染色;  透射电镜观察、照相。

　　1.2.6  统计学处理    　　应用SPSS11.0软件：进行统计学处理，MTT法检测的抑制率之间的比较采用t检验。

　　2  结果

　　2.1  MTT法检测CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞的抗增殖及细胞毒结果    　　随着效靶比增加及作用时间延长，其细胞毒性明显增强。相同作用时间不同效靶比之间有显著性差异（P<0.01或P<0.05），同一效靶比不同作用时间之间也有显著性差异（P<0.01）。当效靶比为30∶1时，其抑制率为48.60%±9.57%，接近半数抑制浓度，有效作用时间为24h，见表1。

　　表1  用MTT法测定CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞株的抑制率（略）

　　Note: Compared with the former at the same timeΔP<0.05; Compared with the former at the same time *P<0.01;Compared with the former at the same E/T ▲ P<0.01(n=6)

　　2.2  形态学观察    　　在倒置显微镜下观察到CIK逐渐聚集到乳腺癌细胞周围，呈典型的玫瑰花环状改变，乳腺癌细胞胞浆内出现颗粒状物，乳腺癌细胞逐渐模糊、消失。效靶细胞共育24h时乳腺癌细胞数明显减少，48h乳腺癌细胞明显漂浮，并且在培养液中出现碎片。对照组乳腺癌细胞仍贴壁生长，状况良好。单独CIK细胞未见趋动现象，均匀铺满视野，见图1、2。    　　在透射电镜下，体外培养的CIK细胞与ZK751乳腺癌细胞亦易于鉴别：前者细胞与外周血淋巴细胞相似。而乳腺癌细胞则核大而形状不规则，核内异染色质很少，核仁大而致密，癌细胞表面有许多大小、形状不一的突起，胞浆内含有丰富的游离核糖体、粗面内质网和线粒体。在效靶细胞（效靶比为30∶1）共育4h后，效靶细胞直接接触或呈犬牙状交错，可见到靶细胞核内已开始浓缩的异染色质，核仁分解为许多嗜锇酸的细小颗粒，分布于核中央，核膜已经模糊不清，胞浆内线粒体外膜开始破坏，但细胞膜完整的细胞凋亡现象， 见图3。效靶细胞共育12h后，变性死亡的癌细胞逐渐增多，癌细胞死亡的方式以凋亡为主，可见大小不等的凋亡细胞和凋亡小体及散在的有质膜包绕的细胞碎片。有的癌细胞遭到严重破坏，核高度浓缩，胞浆内出现许多空泡。效靶细胞共育24h后，绝大多数靶细胞死亡，可见细胞核碎裂，细胞膜不完整，细胞浆内细胞器溶解形成碎片，见图4。

　　图1  CIK细胞聚集到肿瘤细胞周围呈典型的玫瑰花环状(HE×400倍）（略）

　　图2  肿瘤细胞胞浆出现颗粒状物，细胞膜模糊、消失（ HE×400倍）（略）

　　图3  效靶细胞共育4h后，效靶细胞直接接触或呈犬牙状交错，可见细胞膜完整的细胞凋亡现象（透射电镜×2 500）（略）

　　图4  效靶细胞共育24h后，绝大多数靶细胞死亡，可见细胞核碎裂，细胞膜不完整的凋亡小体（透射电镜×4 000倍）（略）

　　3  讨论    　　CIK细胞是将人外周血单个核细胞在体外多种细胞因子（如抗CD3McAb、IL2、IFNγ等）共同培养一段作用时间后获得的一群异质细胞，是一类非主要组织相容性复合物（Major gistocompatibility complex,MHC）和非T细胞受体（T  cell receptor, TCR）限制性的免疫活性细胞[2]，以CD3＋CD56＋T细胞为主。

 　　利用细胞培养的筛选体系可以在体外对人体癌细胞进行抗癌效力检测，从而加快筛选速度[3]。本实验通过MTT法观察CIK细胞以不同浓度，不同效靶比作用于ZK751乳腺癌细胞不同作用时间后所测的抑制率。结果表明:随着效靶比增加及作用时间延长，其细胞毒性明显增强。相同作用时间不同效靶比之间有显著性差异（P<0.01），同一效靶比不同作用时间之间也有显著性差异（P<0.01）。说明CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞株均有抗增殖作用。倒置显微镜、光镜和透射电镜从细胞和亚细胞水平均观察到CIK细胞具有较强的攻击、杀伤ZK751乳腺癌细胞的功能。CIK细胞包围靶细胞使靶细胞发生两种变化。一种为细胞凋亡，表现为靶细胞体积缩小，胞浆减少，核固缩。另一种表现为靶细胞肿胀，胞膜破裂内容物流出而坏死。目前关于CIK细胞对靶细胞的杀伤原理尚不清楚。实验证明CIK细胞活化后产生大量炎性细胞因子如IFNr、TNFa、IL2 等。不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。Mehta等[4]认为CIK细胞对靶细胞杀伤有两条途径：第一，CIK细胞被淋巴细胞功能相关抗原－１（LFA1）有关识别结构激活导致胞浆毒性颗粒依赖性的溶细胞作用，这条途径与胞浆内环磷酸腺苷（cAMP）浓度无关；第二，CIK细胞表面的CD3样受体被结合而激活CIK细胞产生胞浆毒性颗粒介导的溶细胞作用，这条途径与胞浆内环磷酸腺苷（cAMP）浓度有关；而且这两种途径最后都通过刺激CIK细胞释放颗粒酶、穿孔素而裂解靶细胞，提示细胞裂解可能是杀伤靶细胞的主要机制。    　　在与靶细胞结合的部分CIK细胞内有一种特殊的微管泡状结构，表面光滑，这种特殊结构可能与CIK细胞的杀伤功能有关[5]。还有的CIK细胞内溶酶体含量增多，这与CIK细胞杀伤活性有关，具有溶解活性的杀伤细胞是富含溶酶体的细胞[6]。    　　本实验结果显示出CIK细胞抗肿瘤作用的巨大潜力，为CIK细胞应用于临床治疗提供了实验依据。

【参考文献】  　　［1］ 黄文荣.细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞的研究现状[J].肿瘤防治研究, 2000，27（2）：157159.

　　[2] SchmidtWolf IG,Lefterova P,Mehta BA,et al.Phenotypic chatracterization and identiflication of cytokineinduced killer cells[J].EXP Hematol, 1993,21(13):16731679.

　　[3] 丘仑兴.用MTT改良法检测肿瘤细胞化疗药物敏感性[J]. 江西医学院学报, 1997，37（2）：2124.

　　[4] Bela A Mehta， SchmidtWolf IGH， Weissman IL，et al.Two pathways of exocytosis of cytoplasmic granule cotents and target cell killing by cytokineinduced CD3+CD56+killer cells[J].Blood, 1995，86 (2):34933499.

　　[5] 陈德蕙.淋巴因子激活杀伤（LAK）细胞杀伤肝癌细胞的超微结构研究[J]. 中华病理学杂志, 1991，20（3）：190193.

　　[6] 李春瑛，李日镛. rIL2激活的人胎胸腺细胞在体外杀伤肝癌细胞的形态学研究[J]. 临床与实验病理学杂志, 1994，10（4）：283285.