Ki67反义寡核苷酸抑制人肝癌细胞株HEPG7402生长的体外试验

摘要】  目的 通过观察硫代磷酸化修饰的Ki67抗原反义寡核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotide, ASODN)抑制Ki67抗原表达，从而抑制HEPG7402细胞体外增殖,为今后肝癌的基因治疗提供新的手段。方法 将Ki67反义寡核苷酸(ASODN)作用于HEPG7402细胞, MTT比色法测细胞增殖活性;免疫细胞化学(Immunocellulerchemistry ICC)方法检测Ki67标记指数（Labeling index LI）、RTPCR方法观察Ki67 mRNA水平的改变。结果 Ki67 ASODN作用组HEPG7402细胞增殖受到明显抑制;Ki67标记指数(LI)下降,Ki67mRNA合成减少。结论 针对Ki67的反义寡核苷酸能抑制人肝癌细胞株的体外生长。

【关键词】  Ki67 反义寡核苷酸 Ki67标记指数 肝癌

　　0  引言    　　肝癌是我国消化道常见肿瘤之一，常规手术治疗根治率低，其他治疗手段效果一般。基因治疗是目前肿瘤治疗中一种较有前景的治疗方法。反义核酸技术是利用一断人工合成的寡核苷酸与异常表达或过度表达的目的基因或目的基因mRNA互补结合，可以在复制、转录、翻译等多个水平上抑制目的基因的表达，达到治疗的目的。肿瘤的发生与细胞的过度增殖有关，本实验通过将一段针对细胞核增殖相关抗原Ki67翻译起始区的反义寡核苷酸片断，作用于人肝癌细胞HEPG7402，观察对肝癌细胞HEPG7402增殖的影响。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料    　　人肝癌细胞HEPG7402购自中科院上海细胞研究所； Ki67免疫组化试剂盒、SP试剂盒购自福州迈新试剂公司；Trizol RNA抽提试剂盒、AMV RTPCR扩增试剂盒为上海生工公司产品。针对Ki67的反义链(ASODN)序列：5’ACC AGG CGT CTC GTG GGC CAC AT3’; 随机链（ROND）序列：5’AGT ACT CAG TAA CGC CTA CGG TAA G 3’;上述序列3’端3个碱基硫代磷酸化修饰，HLPC纯化处理。寡脱氧核苷酸的合成及纯化由上海生工公司完成。

　　1.2  方法

　　1.2.1  细胞培养及实验分组    　　人肝癌细胞HEPG7402在含10％小牛血清、100U/L青霉素/链霉素的RPMI1640培养基,37℃,5% CO2饱和湿度下培养。实验分组根据加入药物的不同分为反义核酸作用组(ASODN组)、随机寡核苷酸组(ROND组)和对照组。

　　1.2.2  MTT法[1]检测细胞增殖活性    　　将ASODN作用于HEPG7402，分别于24、48、72、96h加入0.5% MTT   20μl,孵育4h后吸弃培养基，加入DMSO 150μl，紫色结晶完全溶解后，用酶标仪检测各组细胞的490nm吸光度值。

　　1.2.3  免疫细胞化学法检测标记指数（LI）    　　制备细胞爬片，经药物处理培养48ｈ后取出玻片,采用免疫细胞化学SP法，根据试剂说明操作。以细胞核呈棕红色为阳性;单纯细胞浆着色而细胞核无着色,或细胞核、细胞浆均无着色为阴性。通过计算 Ki67标记指数（LI）反映Ki67抗原表达量的改变。

　　1.2.4  RTPCR观察Ki67 mRNA水平的改变    　　收集各组细胞，用Trizol柱式总 RNA抽提试剂盒提取总RNA，按照AMV一步法 RTPCR扩增试剂盒说明操作。Ki67  mRNA上游引物5’TTT GGG TGC GAC TTG ACG A –3’；下游引物5’TGA TAG TAA CCA GGC GTC TCG T –3’，产物181bp。内参GAPDH上游引物5’CCA CCC ATG GCA AAT TCC ATG GCA –3’；下游引物5’TCT AGA CGG CAG GTC AGG TCC ACC –3’，产物598bp。由上海生物工程公司合成。

　　1.2.5  统计学分析    　　采用SPSS10.0软件分析,多组均数间的比较,检验方差齐性后行方差分析。

　2  结果

　　2.1  ASODN对HEPG7402细胞生长曲线的影响    　　ASODN作用组，24～72h细胞增殖受到抑制，抑制作用与对照组相比有统计学意义P＜0.05，96h以后抑制作用减弱，见图1。

　　2.2  ASODN作用下Ki67 LI改变    　　ASODN作用组，当ASODN浓度为2.5μmol/L 时，LI改变与对照组无明显区别（P＞0.05），随ASODN浓度增加，Ki67 LI明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

　　2.3  RTPCR观察Ki67  mRNA水平改变    　　空白对照组和RODN组中可见一条清晰的181bp的Ki67基因片段, ASODN处理组Ki67基因表达下降,表明Ki67mRNA基因的表达明显被抑制，见图2。

　　图1  各组药物对 HEPG7402细胞生长曲线的影响（略）

　　表1  ASODN对HEPG7402细胞LI的影响（略）

　　vs control group  ★P＞0.05;vs control group  ▲P＜0.01; vs each other ◆ P＜0.05

　　1： Marker;   2： Control;   3： ASODN;   4： RODN;  5： GAPDH

　　图2  RTPCR法观察ASODN对HEPG7402细胞Ki67  mRNA水平的影响（略）

　　3  讨论    　　Ki67抗原是一种增殖细胞标记抗原,其具体功能至今仍未阐明[2]。Ki67抗原的表达随细胞周期的不同而发生改变,在G1中期到晚期出现, S期和G2期逐渐增加，M期达到最高值, G0期细胞阴性[3]，是一项反应细胞增殖水平的常用指标。也是目前已知的增殖抗原中较具增殖能力代表性的指标。肿瘤细胞与正常细胞的主要区别在于前者的细胞周期发生紊乱、细胞异常增殖。大量实验证明Ki67抗原与多种肿瘤细胞的增殖活性、细胞周期以及肿瘤的生长方式、复发、转移等多种生物学行为相关。临床上常用一种反映Ki67抗原表达水平的指标是Ki67标记指数(LI)，Yoshimoto等[4]利用Ki67单克隆抗体免疫组化方法观察到肝细胞癌（HCC）组织中LI明显高于慢性肝炎（CH）、肝硬化（LC）和正常肝组织，说明肝癌细胞中Ki67抗原呈高表达。    　　本实验将一断序列特异性反义寡核苷酸（ASODN）作用于人肝癌细胞HEPG7402 Ki67  mRNA翻译起始区,抑制Ki67抗原的表达，来观察对该细胞增殖特性的影响。结果显示ASODN作用组细胞增殖受到明显抑制，抑制程度呈剂量依赖性（数据未列出）。以10μmol/L ASODN作用于HEPG7402，发现48h细胞抑制程度最明显，细胞抑制率存在时间依赖性，但96h以后抑制率降低，可能与寡核苷酸半衰期短以及受细胞内核酶降解有关。经ASODN作用后Ki67  LI明显下降，说明ASODN抑制了Ki67抗原表达。同时RTPCR方法观察到ASODN作用组Ki67  mRNA表达水平下降，说明反义寡核苷酸通过与Ki67翻译起始区结合，通过抑制Ki67mRNA水平，使其Ki67抗原表达下降，细胞增殖受到抑制。    　　Kausch等[5]将Ki67 ASODN作用于RT4细胞后发现Ki67蛋白表达量明显下降，肿瘤细胞的增殖受到抑制。用上述寡核苷酸注射皮下植有膀胱间皮瘤细胞的C57B6 小鼠后观察到肿瘤体积缩小。提示Ki67 ASODN无论在体外或体内都能起到明显的抑制肿瘤细胞增殖的效果。Zheng等[6]以Ki67抗原为靶点反义肽核酸（PNA）作用于786－0细胞，观察到该肿瘤细胞增殖受到抑制。上述实验证明，肿瘤细胞由于呈现高增殖的特点，而Ki67抗原是一种与增殖密切相关的抗原，抑制Ki67抗原蛋白的表达可以明显抑制肿瘤细胞的增殖，达到治疗肿瘤的目的。我们在本实验中发现反义Ki67寡核苷酸 (ASODN)能使体外培养的HEPG7402细胞增殖受到抑制，是否对体内的肝癌细胞有抑制作用有待于今后进一步研究。

【参考文献】  　　［1］ 郝新保，张利朝，殷缨，等.MTT比色法测定细胞生长曲线[J].第四军医大学学报，1997，18（4）：309391.

　　［2］ Endl E, Gerdes J. The Ki67 protein: fascinating forms and an unknown function[J]. Exp Cell Res， 2000 (257): 231237.

　　［３］ Gerdes J, Lemke H, Baisch H,et al. Cell cycle analysis of a cell proliferationassociated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki67[J]． Journal of Immunology， 1984 (133): 17101715.

　　［４］ Yoshimoto J, Iwata T, Takamori S,et al. Useflness of monoclonal antibody Ki67 as a prognostic factor of hepatocellular carcinoma[J].International Hepatology Communications，1997(6):209218．

　　［５］ Kausch I, Lingnau A, Endl E, et al. Antisense treatment against the Ki67mRNA inhibits proliferation and tumor growth in vitro and in vivo[J]. Int J Cancer， 2003 (105): 710716.　　　　［６］ JunNian Zheng, YaFeng Sun, DongSheng Pei,et al. AntiKi67 peptide nucleic acid affects the proliferation and apoptosis of human renal carcinoma cells in vitro[J].Life Sci, 2005，(16):18731881.