人食管鳞癌细胞的体外培养及生物学性状

人食管鳞癌细胞的体外培养及生物学性状作者：徐驯宇， 孙志刚， 黄盛东， 方超英， 林 兴， 曾志勇    作者单位：1.福建省立医院 胸外科、福建医科大学 省立临床医学院，福州 350001；2.第二军医大学 长海医院胸心外科，上海 200433；3.南京军区福州总医院 胸心外科，福州 350025     【摘要】  目的 研究人食管鳞癌细胞的体外培养及生物学性状。 方法 自原发食管鳞癌组织中获取标本，应用消化培养法培养出可连续传代的肿瘤细胞，对培养的细胞进行形态学观察、免疫组织化学鉴定；MTT法测定细胞数，绘制生长曲线和计算细胞倍增时间，平板克隆实验以测定平板克隆形成率、流式细胞仪测定细胞周期分布。 结果 30例患者的肿瘤组织有6例成功体外培养出肿瘤细胞，培养出的细胞符合鳞癌特性；细胞生长具有平台期，细胞倍增时间（33.12±6.10）h，平板克隆形成率（15.73±4.46）%；(77.57±6.57)%细胞处于细胞增殖的G0、G1期，少数细胞处于活跃的增殖期。 结论 人食管鳞癌细胞成功获得了体外培养；肿瘤细胞的增殖能力不同，只有少数细胞增殖活跃。     【关键词】  食管肿瘤； 癌，鳞状细胞； 肿瘤细胞，培养的； 肿瘤干细胞    目前，在白血病、多发性骨髓瘤以及肺癌、卵巢癌、乳腺癌、神经母细胞瘤等肿瘤的研究提示，肿瘤细胞的增殖能力不同，大部分肿瘤细胞已经失去了生长潜能，只有一小部分细胞具有无限增殖和在体内外形成肿瘤的能力，这些细胞被称作肿瘤干细胞，是肿瘤组织中具有自我更新、分化及增殖能力的肿瘤细胞，虽只占肿瘤细胞的一小部分，却是肿瘤起源、发展与转移的根源[17]。肿瘤干细胞如能成功分离鉴定，靶向肿瘤干细胞的治疗策略可能是癌症治疗的一个方向。本系列研究在成功建立能够体外长期培养的食管上皮细胞系的基础上，旨在研究食管癌中是否存在着肿瘤干细胞[8]。本实验首先对人食管鳞癌细胞进行体外原代培养，并对培养的可连续传代的食管鳞癌细胞系进行生物学特性研究。1  材料和方法    1.1  人食管鳞癌细胞的体外培养    1.1.1  标本  来源于本院及上海长海医院30例行食管癌手术（术前无放、化疗史）患者的肿瘤组织，均经病理确诊为鳞状细胞癌。手术切除肿瘤后，立即切取小块癌变组织置于含双抗（青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL）PBS液无菌培养基的小瓶内，去除坏死组织，剪碎至1～2 mm3。    1.1.2  将标本置于培养瓶中，加入10％胶原酶（美国Amresco公司）的含血清DMEM培养基（美国Gibco公司）5 mL，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2的培养箱内消化过夜；次日1 000 r/min离心；分瓶接种，加入含血清的培养基，37 ℃、体积分数为0.05的CO2中培养，每48～72 h换液1次。待有细胞贴壁生长后，用记号笔在倒置显微镜下对成纤维细胞生长的地方作标记，用自制的细胞擦刮除成纤维细胞，反复进行，直到上皮样肿瘤细胞纯化为止。细胞生长至80%汇合时，0.25%胰酶消化，继续传下一代。第3代起细胞生长逐渐稳定，一般3～5 d传代1次（1∶2～3稀释）。    1.2  人食管鳞癌细胞的生长曲线  取20代以上的对数生长期的细胞，稀释为2×104 mL-1，以每孔200 μL接种于96孔培养板中，每间隔24 h进行噻唑兰（MTT）法测定细胞数。每孔加入MTT 20 μL，培养4 h，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL显色，酶联免疫检测仪于570 nm处测定各孔光密度值（D），绘制细胞生长曲线。计算细胞的倍增时间（Patterson公式）：    Td=Tlg2/lg（Nt/N0）    Td：倍增时间（h）；T：细胞数由N0增至Nt所用时间；N0：起始细胞数，Nt：第t天的细胞数。    1.3  平板克隆形成率  取第20代以上的80%汇合细胞，制成单细胞悬液，加入6孔板内，每孔接种400个细胞，培养13 d后，纯甲醇固定30 min，Giemsa染色15 min，晾干。计算细胞数>50的克隆数。    克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%    1.4  细胞周期  20代以上90%以上汇合细胞，用体积分数为70%的乙醇溶液4 ℃固定1 h，加入RNA酶，孵育30 min，加入碘化丙啶染液染色30 min，FAC Scan流式细胞仪测定荧光强度，CELL QUEST软件采集数据，Modfit LT 2.0软件进行DNA含量分析，确定细胞周期分布。    1.5  细胞爬片免疫组织化学  把部分细胞培养在小盖玻片上，3～4 d后取出盖玻片，纯丙酮固定，一抗为CK7鼠单克隆抗体（细胞角蛋白抗体，美国Sigma公司），二抗为羊抗小鼠/兔IgG（美国Santa Cruz公司），DAB显色。2  结  果    30例肿瘤组织有6例成功体外培养出肿瘤细胞，其临床资料见表1。 表1  体外成功培养出可传代肿瘤细胞的6例患者的临床资料    2.1  形态学观察  第2天大部分细胞已贴壁，上皮细胞聚集成小团块状，较规则、圆形、透亮。原代培养第3～4天上皮细胞团块周边开始出现细胞爬出，并逐渐形成上皮晕，第12～18天上皮细胞可铺满瓶底的70％～80％（图1）。细胞主要呈三角形、多角形或短梭形，大小不等，细胞质丰富，胞核圆形、卵圆形，大小不等，体积增大（图2A、2B）；电镜下核形不规则，核质比增大或增大不明显，核仁明显，1～6个，核分裂活跃，细胞质中细胞器较少，线粒体峭少而短，可见较多粗大的张力原纤维束及细胞间桥粒（图2C）。细胞爬片免疫组织化学染色示CK7染色阳性（图2D）。传代后，12 h后细胞基本完成贴壁，3～5 d即可形成连续的单细胞层。此后细胞生长逐渐稳定，在体外持续生长9～12月，可传至第40代以上。传代细胞的形态特征和原代细胞基本相同。    2.2  细胞生长曲线  生长曲线呈近似“S”形，细胞接种培养后第1～2天为生长潜伏期，第3～5天为指数增生期，第7天后即进入平台期（图3）。细胞群体倍增时间为（33.12±6.10）h（表2）。    2.3  平板克隆形成率及细胞周期  细胞生长融合>90%时，大多数细胞处于静止期，少数细胞处于    细胞角蛋白阳性染色位于细胞质，呈棕黄色颗粒.3  讨  论    食管癌肿瘤细胞原代培养较为困难[9]。目前已报道的来源于中国人原发食管癌细胞系大约10个。笔者采用的30例标本中，只有6例获得成功。目前培养的方法有消化培养法、组织块培养法、机械分解培养法。笔者前期比较了这几种培养方法，只有消化培养获得成功。这可能是因为组织块经胶原酶消化后上皮细胞间粘附较疏松，易于游出生长；胶原酶能较特异地消化纤维组织，使纤维组织分散表2  食管鳞癌细胞培养的倍增时间、平板克隆形成率及细胞周期    成单个细胞或小细胞团，而癌上皮细胞团对胶原酶较不敏感，消化后形成细胞团，比重较大，选择细胞悬液的下层细胞悬液进行培养提高了成功率。因此笔者在食管癌肿瘤细胞原代培养时倾向使用消化培养法。    笔者初步建立的食管癌细胞系均是来源于分化较高（中至高分化）的食管鳞状细胞癌患者。培养的细胞电镜下具有核形不规则、核质比增大、核仁明显、核分裂活跃等细胞异型性，具有张力原纤维束及细胞间桥粒等鳞状上皮细胞的特点；细胞爬片免疫组化染色示CK表达强阳性，表明其为鳞状上皮来源。对可连续传代的食管鳞癌细胞系进行生物学特性研究，发现这些细胞的生长曲线呈近似“S”形，约到7 d进入平台期生长；在平板形成克隆的能力较强，但并非所有肿瘤细胞都能无限生长；大多数细胞处于细胞增殖的G0、G1期，少数细胞处于活跃的增殖期。这些结果初步验证了肿瘤干细胞的理论，即肿瘤细胞的增殖能力不同，大部分肿瘤细胞在增长过程中逐渐失去了生长潜能，处于细胞增殖的静止期，只有少数细胞增殖活跃。    本研究成功对人食管鳞癌细胞进行了体外培养，并对培养的可连续传代的食管鳞癌细胞系进行生物学特性研究，为下一步研究食管癌中是否存在着肿瘤干细胞奠定了基础。【参考文献】   [1] Gluzman D F,Nadgornaya V A,Sklyarenko L M, et al. Study of morphocytochemical and immunophenotypic features of acute leukemia stem cells[J]. Exp Oncol，2008,30(2):102105.   [2] Matsui W,Wang Q,Barber J P, et al. Clonogenic multiple myeloma progenitors, stem cell properties, and drug resistance[J]. Cancer Res, 2008,68(1):190197.   [3] Sung J M, Cho H J,Yi H, et al.Characterization of a stem cell population in lung cancer A549 cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 371(1):163167.   [4] Zhang S,Balch C,Chan M W, et al. Identification and characterization of ovarian cancerinitiating cells from primary human tumors[J]. Cancer Res, 2008,68(11):43114320.   [5] AlHajj M,Wicha M S,BenitoHernandez A, et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J]. Proc Natl Acad Sci, 2003,100(7):39833988.   [6] Hansford L M,McKee A E,Zhang L, et al. Neuroblastoma cells isolated from bone marrow metastases contain a naturally enriched tumorinitiating cell[J]. Cancer Res, 2007,67(23):1123411243.   [7] HombachKlonisch S,Paranjothy T,Wiechec E. Cancer stem cells as targets for cancer therapy: selected cancers as examples[J]. Arch Immunol Ther Exp, 2008, 56(3):165180.   [8] 刘洪涛,黄盛东,张宝仁,等. 成人食管上皮细胞的体外培养及生物学特性[J]. 解剖学报, 2008,39(1):6063.   [9] Wada Y,Yoshida K,Tsutani Y, et al.Neutrophil elastase induces cell proliferation and migration by the release of TGFalpha, PDGF and VEGF in esophageal cell lines[J]. Oncol Rep, 2007,17(1):161167.