NS398对肝细胞癌VEGF、MMP9表达的调节

【摘要】  目的 探讨NS398对肝细胞癌血管生成和侵袭的调节作用。方法 NS398取0、25、50、75、100μmol/L 5个浓度组，每个浓度组选取24h、48h、72h三个作用时间点进行检测。采用RTPCR和流式细胞技术，观察NS398对人肝癌SMMC7721细胞株VEGF、MMP9表达的影响。结果 NS398对SMMC7721细胞有明显的生长抑制作用。与对照组相比，NS398能显著抑制SMMC7721细胞COX2、VEGF、MMP9基因和蛋白表达，并呈显著的剂量和时间依赖性关系（P<0.001）。结论 NS398能显著抑制SMMC7721肝细胞癌中VEGF、MMP9 mRNA和蛋白的表达。

【关键词】  肝细胞癌 NS398 血管内皮生长因子 MMP9

　　0  引言    　　环氧合酶2（Cyclooxygenase2，COX2）不但与肿瘤血管生成有关［1］,还可通过改变肿瘤细胞的侵袭性和粘附性来抑制肿瘤生长［2］。我们以前实验表明肝细胞癌组织中COX2与VEGF、MMP9蛋白表达和肿瘤微血管密度（Microvessel density，MVD）之间呈正相关［3］，本实验研究COX2特异性抑制剂——NS398对肝癌SMMC7721细胞株VEGF、MMP9表达的影响，初步探讨NS398对肝细胞癌血管生成和侵袭的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  细胞培养和药物干预方案    　　SMMC7721细胞分别用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液在含5％  CO2 37℃培养箱中培养。培养液中分别含有青霉素、链霉素100U/ml。将对数生长期的细胞接种于96孔培养板，待细胞贴壁后加入NS398。NS398取0、25、50、75、100μmol/L 5个浓度组，每个浓度组选取24h、48h、72h三个时间点。每个实验组重复6孔。

　　1.2  主要试剂    　　NS398购自sigma公司。一抗山羊抗人COX2多克隆抗体，鼠抗人VEGF单克隆抗体，兔抗人MMP9单克隆抗体均为Santa Cruz产品， Trizol试剂（美国Gibco BRL公司）。PCR仪（美国PE公司PE9600型），流式细胞仪（美国BC公司EpicsXLⅡ型）。

　　1.3  RTPCR检测COX2、VEGF、MMP9 mRNA的表达    　　按照Trizol试剂说明书逐步提取细胞总mRNA。COX2反应条件为: 94℃变性30s；63℃复性30s；72℃延伸30s。VEGF反应条件为: 94℃变性30s；63℃复性30s；72℃延伸30s。MMP9反应条件为： 94℃变性30s； 63℃复性30s； 72℃延伸30s。进行35个循环后进一步延伸72℃ 5min。COX2引物序列: 上游为5’AAT GAG TAC CGA AAA TTC3’，下游为5’CAT CTA GTC CGG AGC GGG AAG3’，扩增片段大小为420bp。VEGF引物序列: 上游为5’TTG CCT TGC TGC TCT ACC TC 3’，下游为5’AAA TGC TTT CTC CGC TCT GA 3’，扩增片段大小为418 bp。MMP9引物序列：上游：5’TTG CCT TGC TGC TCT ACC TC3’，下游：5’AAA TGC TTT CTC CGC TCT GA 3’,扩增片段大小为120bp。所有引物均由上海生工公司合成，选取βactin为内参照，取10μl  PCR产物用1.2%的普通琼脂糖凝胶电泳后，凝胶电泳成像系统观测成像情况。

　　1.4  流式细胞仪定量检测COX2、VEGF、MMP9的表达    　　采用间接免疫荧光标记方法。每份样品加入第一和第二抗体工作液各100μl。设有PBS代替一抗和二抗的阴性对照，只加一抗和二抗的阳性对照。以荧光指数（FI）表示相对含量，FI=（样品蛋白表达荧光强度正常样品的荧光强度）/正常样品的荧光强度。

　　1.5  MTT法检测细胞增殖抑制情况    　　在96孔培养板中分别加入25、50、75、100μmol/L NS398，继续孵育24、48、72h后每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃继续孵育4～5h，吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μl   DMSO，振荡10min。用酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度（A）。每组取3次实验平均值，计算细胞抑瘤率：抑瘤率＝（对照组A－实验组A）／（对照组A－空白组A）×100%。

　1.6  统计学检验    　　应用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析，组间显著性检验采用析因设计方差分析，P<0.05为差异有显著性。

　　2  结果

　　2.1  NS398对SMMC7721细胞生长的影响    　　MTT法测定结果显示，NS398对SMMC7721细胞有明显的抑制生长作用，并呈剂量依赖性和时间依赖性（P<0.001）, 见图1。

　　2.2  NS398对SMMC7721细胞COX2表达的影响    　　RTPCR和FCM结果表明，NS398能显著抑制SMMC7721细胞COX2基因和蛋白表达，并呈显著的剂量和时间依赖性关系（P<0.001）。

　　图1   NS398 对SMMC7721细胞生长的抑制作用（略）

　　2.3  NS398对SMMC7721细胞VEGF、MMP9表达的影响    　　NS398能显著抑制SMMC7721细胞VEGF、MMP9基因和蛋白表达，并呈显著的剂量和时间依赖性关系（P<0.001），见表1、2。

　　表1  NS398对SMMC7721细胞COX2、VEGF、MMP9蛋白表达的影响（略）

　　表2  NS398对SMMC7721细胞COX2、VEGF、MMP9 mRNA表达的影响（略）　　　　3  讨论    　　COX2新近被证实具有促进肿瘤生长作用，可影响肿瘤细胞增殖、分化和凋亡，最近还发现COX2可通过刺激肿瘤血管生成、促进细胞侵袭和转移能力来促进肿瘤发生和发展。血管生成是肿瘤发生、发展过程中的重要步骤，与肿瘤的生物学行为及预后有关。VEGF是肿瘤血管生成和侵袭转移过程中的关键因素，其通过特异性受体Flk1、Flt1和Flt4选择性作用于内皮细胞发挥作用。MMP9是基质金属蛋白酶家族中的重要成员，其过度表达与肝细胞癌血管生成和侵袭转移密切相关。    　　已有研究表明COX2在肝细胞癌中高表达，但对COX2与肿瘤血管生成的研究较少。Tsujii等［1］研究发现，转染COX2基因可以使培养的结肠癌细胞株在过度表达COX2的同时，促使VEGF、TGFβ和bFGF等肿瘤血管生成因子的分泌，并促进联合培养的人脐静脉内皮细胞株在Ⅰ型胶原凝胶中增殖、变形、向肿瘤细胞迁移和形成网状的内皮细胞索。Liu等［4］进一步进行体内研究，结果显示选择性COX2抑制剂能显著抑制前列腺癌血管生成。Tsujii等［5］将COX2基因转染入人结肠癌细胞株，发现该转染细胞具有更强的侵袭能力，同时可以被COX2选择性抑制剂阻断。进一步研究发现，这种侵袭能力的增强与MMP2的活化及MMP1的表达增加有关。以前实验已证实肝细胞癌组织中COX2与VEGF、MMP9和MVD表达之间存在着正相关，本研究结果显示COX2特异性抑制剂NS398可以显著降低肝癌SMMC7721细胞株VEGF基因和蛋白的表达水平，进一步表明在肝细胞癌COX2可通过上调VEGF与MMP9表达水平来促进肿瘤血管生成和侵袭。    　　肿瘤细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞在细胞因子诱导下，可上调COX2表达[6]，增加的PGEs与PGE受体结合，通过EP/cAMP等途径激活各种胞内激酶，与核内受体PPARγ等结合后作用于或直接作用于VEGF、MMP9基因[7]，诱导VEGF、MMP9表达水平上调，但具体机制尚有待于进一步研究。

【参考文献】  　　［1］ Tsujii M, Kawano S, Tsuji S,et al. Cyclooxygenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells[J]. Cell,1998,93(5):705716.

　　［2］ Tsujii M, DuBois RN. Alterations in cellular adhesion and apoptosis in epithelial cells overexpressing prostaglandin endoperoxide synthase 2[J]. Cell,1995,83(3):493501.

　　［3］ 彭利, 左连富, 王顺祥,等. 肝癌组织中COX2、VEGF、MMP2、MMP9的表达及相互关系的免疫组织化学研究[J]. 实用肿瘤杂志，2005，20（2）：134136.

　［4］ Liu XH, Kirschenbaum A, Yao S, et al. Inhibition of cyclooxygenase2 suppresses angiogenesis and the growth of prostate cancer in vivo[J].J Urol, 2000,164（3 pt 1）:820825.

　　［5］ Tsujii M, Kawano S, DuBois RN. Cyclooxygenase2 expression in human colon cancer cells increases metastatic potential[J]. Proc Natl Acad Sci,1997,94（7）:33363340.

　　［6］ Mestre JR, Mackrell PJ, Rivadeneira DE, et al. Redundancy in the signaling pathways and promoter elements regulating cyclooxygenase2 gene expression in endotoxintreated macrophage/monocytic cells[J]. J Biol Chem, 2001, 276（6）: 3977 3982.

　　［7］ Bamba H, Ota S, Kato A, et al. Prostaglandins upregulate vascular endothelial growth factor production through distinct pathways in differentiated U937 cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 273(2): 485491.