Stat5反义寡核苷酸联合Jak激酶抑制剂AG490调控结肠癌细胞增殖与凋亡的分子机制

【摘要】  目的 探讨Stat5反义寡核苷酸（Stat5 ASON）联合Jak激酶抑制剂（AG490）治疗结肠癌的作用机制。方法 应用Stat5 ASON与AG490处理结肠癌细胞HT29，Western blot检测Stat5、pStat5、cyclin D1与BclxL表达，MTT法检测细胞增殖状态，流式细胞技术检测细胞周期与凋亡。结果 Stat5 ASON与AG490作用于HT29细胞72h后，G1期细胞比率由72.7%上升至87.2%，S期细胞比率分别由19.6%，下降至7.5%，凋亡细胞百分比由8.7%增加至24.2%。Stat5 ASON与AG490可以抑制结肠癌细胞增殖，促进结肠癌细胞凋亡，联合应用Stat5 ASON与AG490可以起协同作用，明显抑制结肠癌细胞Stat5信号转导通路活化。结论 选择性阻断细胞内信号转导通路可能为治疗结肠癌提供新途径。

【关键词】  结肠癌 信号转导 增殖 脱嗜作用

　　0  引言    　　研究显示，细胞内信号转导通路异常激活与多种肿瘤的发生、发展密切相关[1]。本研究应用Stat5反义寡核苷酸与Jak激酶抑制剂AG490处理结肠癌细胞，观察对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响，探讨以Stat5信号转导通路为靶点在药物治疗结肠癌中的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  细胞培养    　　人结肠癌细胞HT29，培养于含有10%胎牛血清（美国HyClone公司）的RPMI1640培养基（美国GIBCOL/BRL公司）。JAK激酶抑制剂AG490（美国Calbiochem公司）。

　　1.2  Stat5寡核苷酸的合成与纯化    　　Stat5反义寡核苷酸根据Stat5翻译起始点合成，同时本研究还设立了正义寡核苷酸链和错配寡核苷酸链作为对照组，错配链的序列在GenBank数据库进行同源性检索，未发现同源序列。（1）Stat5反义寡核苷酸序列：5’CCA CAC AGC CAT GTT TAC CCG3’；（2）Stat5正义寡核苷酸序列：5’CGG GTA AAC ATG GCT GTG TGG3’；（3）Stat5错配寡核苷酸序列：5’CCA CAG AGC CAT GTT TTC CCG3’。以上寡核苷酸由（美国Santa Cruz公司）合成及纯化。

　　1.3  阳离子脂质体转染核苷酸    　　LipofectAmine2000 （美国GIBCOL/BRL公司），转染过程参照GIBCOL/BRL公司手册。

　　1.4  细胞增殖状态检测（MTT法）        　　接种细胞于96孔板，贴壁后，无血清培养细胞16～24h，使细胞同步化。研究分为4组：（1）对照组；（2）AG490组；（3）Stat5 ASON组；（4）Stat5 ASON+AG490组。每个研究点设置3组平行对照，重复3次实验取平均值。空白对照组加无血清培养基，AG490组、Stat5 ASON组与Stat5 ASON+AG490组分别加入AG490与Stat5 ASON，第0、24、48、72h分别加入MTT  5mg/ml （美国Sigma公司），继续培养4h，每孔加入DMSO 200μl，酶标仪测定540nm吸收值，绘制生长曲线。

　　1.5  细胞周期检测    　　无血清培养细胞16～24h，使同步化，分组同上，第0、24、48、72h分别消化细胞，0.5ml PBS重悬细胞，70%冰乙醇固定细胞过夜，加入RNAase A至终浓度50μg/ml，37℃恒温水浴1h，加入PI（美国Sigma公司）至终浓度50μg/ml，4℃避光染色1h，上流式细胞仪FACScan（美国BectonDickinson公司）检测，资料用Cell Quest细胞周期分析软件处理。

　　1.6  细胞总蛋白、胞浆蛋白与核蛋白提取

　　1.6.1  细胞核蛋白提取  收集细胞悬液；用低渗缓冲液于冰上裂解细胞10min；4℃条件下13 000r/min离心1min；4℃条件下用高盐缓冲液重悬粗提的细胞核，振荡30min；4℃条件下13 000r/min离心10min；取上清为核提取物，贮存于-80℃于2个月内用完。

　1.6.2  总蛋白提取  参照Santa Cruz公司蛋白提取方法，应用RIPA缓冲液裂解结肠癌细胞得到总蛋白。

　　1.6.3  蛋白浓度测定方法（Bradford法）  以牛血清蛋白（BSA）作为标准品，根据蛋白定量试剂盒（美国BioRad公司）说明绘制蛋白定量标准曲线，于分光光度计595nm下测光密度值，计算提取液蛋白浓度。

　　1.7  Western blot    　　细胞蛋白样品50μg上样于7.5%的聚丙烯酰胺凝胶经电泳分离后，电转移至PVDF膜（美国Millipore公司），封闭后，加入一抗（Stat5，pStat5，cyclin D1，BclxL，GAPDH）（美国Santa Cruz公司），工作浓度1∶1000；辣根过氧化物酶结合的二抗，（英国Amersham公司），工作浓度1∶1000。用ECL（英国Amersham公司）化学发光试剂盒检测杂交信号。

　　1.8  吸光度测定    　　用Phospho  Imager图像分析仪（美国Molecular Dynamics公司）测定条带的吸光度（A值），以A值代表蛋白的相对表达量。

　　1.9  统计方法    　　应用SPSS 12.0统计学软件，采用独立样本t检验，P<0.05为差异有显著性。

　　2  结果

　　2.1  Stat5在结肠癌细胞中持续活化  见图1。

　　图1  HT29细胞增殖过程中Stat5信号转导通路成员表达与活性变化（略）

　　2.2  Stat5 ASON与AG490可以抑制结肠癌细胞增殖    　　Stat5 ASON与AG490作用于HT29细胞后，细胞增殖水平下降，见图2。Stat5 ASON与AG490作用于HT29细胞72h后，G1期细胞比率由72.7%上升至87.2%，S期细胞比率分别由19.6%，下降至7.5%，细胞增殖受抑制，见图3。

　　HT29细胞增殖水平随Stat5 ASON与AG490作用时间延长而下降

　　图2  HT29细胞增殖状态（略）

　　HT29细胞在Stat5 ASON与AG490联合作用下G1期细胞比率上升，S期细胞比率下降，细胞增殖受抑制

　　图3  HT29细胞周期检测（略）

　　2.3  Stat5 ASON与AG490可以促进结肠癌细胞凋亡    　　Stat5 ASON与AG490作用于HT29细胞72h后，凋亡细胞百分比由8.7%增加至24.2%, 见图4。

　　HT29细胞在Stat5 ASON与AG490作用下凋亡细胞增加

　　图4  HT29细胞凋亡检测（略）

　　2.4  Stat5 ASON与AG490可以使Stat5通路成员活性与表达下降    　　Stat5 ASON与AG490作用于HT29细胞72h后，Stat5表达与活性下调，其靶基因产物bclxL与cyclin D1表达下降，见图5。

　　3  讨论    　　STATs信号转导通路与细胞的增殖、分化及凋亡关系密切，该通路异常活化可导致细胞异常增殖和恶性转化。哺乳动物中STATs 家族由7个成员组成：Stat1～Stat4，Stat5a，Stat5b及Stat6[2]。Stat5最初被称为泌乳素诱导的乳腺因子（Mammary gland factor, MGF），在乳腺上皮细胞增殖与分化中起重要作用[3]。Stat5包括Stat5a与Stat5b两种异构体，结构上具有95%的同源性。研究证实Stat5表达与活化不仅与乳腺癌发生发展密切相关，而且在其他肿瘤如髓样白血病、前列腺癌及头颈部鳞状细胞癌中异常表达与活化[4,5]。

　　Stat5 ASON与AG490对结肠癌作用于HT29细胞72h后对Stat5信号转导通路成员表达与活性下降

　　图5  HT29细胞Stat5信号转导通路成员表达（略）    　　Stat5作为上游酪氨酸激酶通过调控靶基因而诱导某些关键产物的表达来影响肿瘤的发生，重要的靶基因产物包括影响细胞凋亡的Bcl2家族成员[6]。Bcl2家族包括抑凋亡和促凋亡两大类，前者包括Bcl2、BclxL、Mcl1等，后者包括bax、bak、bclxS等[7]。bclx基因启动子上存在多个STATs结合位点，STATs可直接与bclx启动子结合而启动转录[8]。GutierrezCastellanos等[9]在研究慢性髓性白血病（Chronic myelogenous leukemia, CML）时发现，CML患者外周血单核细胞中BclxL表达在慢性期下降，而在急变期迅速升高，逆转录聚合酶链反应（RTPCR）显示在此过程中BclxL转录受到磷酸化Stat5的调控。

　　本研究结果显示Stat5通路在结肠癌细胞HT29增殖过程中持续激活，应用Stat5 ASON作用于结肠癌细胞系HT29，发现HT29细胞增殖水平随Stat5 ASON作用时间延长而下降，相应空白对照组变化不明显。由于结肠癌对化疗药物属中低度敏感，即使最有效的5氟尿嘧啶（5Fu）其反应率仅有20%～30%，因而对其耐药机制的研究仍是热点和难点。为研究Stat5在介导结肠癌药物治疗的作用机制，本研究进一步应用Stat5 ASON，Stat5 ASON+AG490分别作用于HT29细胞，发现HT29细胞增殖水平随药物作用时间延长而下降，以Stat5 ASON+AG490组细胞下降为明显，Stat5 ASON+AG490作用于HT29细胞72h后，细胞增殖受抑制，凋亡细胞增加。Western blot显示： HT29细胞中Stat5、pStat5、BclxL及cyclin D1表达水平明显下降，提示结肠癌细胞耐药可能与Stat5异常激活有关，Stat5 ASON可以协同化疗药物AG490对结肠癌细胞HT29起治疗作用[10]。    　　总之，Stat5信号转导通路在结肠癌细胞中的转录调控机制尚不清楚，Stat5的异常激活与结肠癌细胞凋亡关系还有待于进一步明确[11]。本研究前期工作发现结肠癌细胞耐受化疗与Stat3与Bcl2成员异常增高有关，阻断Stat3通路可诱导肿瘤细胞凋亡[12,13]。进一步研究还发现非甾体抗炎药NS398可以抑制结肠癌细胞Stat5活性，通过信号转导通路间交互作用（crosstalk）抑制结肠癌细胞增殖[14]。深入研究Stat5信号转导通路作用机制有可能为治疗结肠癌提供新的理论和实验基础。    　　(致谢  感谢美国Stowers Institute for Medical Research的Dr. Limei Ma 与Dr. Congrong Yu对本研究提供的技术支持。)

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