阿司匹林对结肠癌细胞株SW480转移侵润潜能影响的初步研究

阿司匹林对结肠癌细胞株SW480转移侵润潜能影响的初步研究作者：黄杰安 赖铭裕 邓德海 姜海行 唐国都 王超    作者单位：广西医科大学第一临床医学院消化内科，广西 南宁 530027；右江民族医学院附属医院消化内科，广西 百色 533000    【摘要】  目的 观察阿司匹林对人结肠癌细胞株SW480生长增殖及转移侵润潜能的影响。方法 以不同浓度（2.5、5.0、10.0mmol/L）的阿司匹林干预体外培养人结肠癌细胞株SW480，应用生长曲线法和MTT比色法观察其生长增殖，体外侵润法观察细胞转移能力，免疫细胞化学染色法检测细胞表面粘附因子CD44v6及抑癌基因nm-23表达的变化。结果 阿司匹林对结肠癌细胞株SW480生长增殖具有抑制作用，在观察的药物浓度和时间范围内，抑制率可达14.5%～91.8%，其效应呈浓度和时间依赖关系。阿司匹林可抑制CD44v6但促进nm-23蛋白的表达，明显降低肿瘤细胞穿透matrigel膜的能力。结论 阿司匹林具有拮抗结肠癌细胞株的生长增殖作用，并降低其转移侵润潜能；抑制CD44v6蛋白，促进nm-23蛋白表达可能是阿司匹林降低细胞侵润能力的分子机理之一。    【关键词】  阿司匹林 结肠肿瘤 肿瘤转移 肿瘤侵润　　The effect of Aspirin on growth and metastasis potential in colorectal cancer cell line SW480　HUANG Jie-an，LAI Ming-yu，DENG DE-hai，JIANG Hai-xing，TANG Guo-du，WANG Chao(Department of Gastroenterology，First Clinical Hospital of Guangxi Medical University，Nanning， Guangxi 530027P.R.China; Department of Gastroenterology，Affiliated Hospital of　Youjiang Medical College for Nationalities，Baise，Guangxi 533000，P.R.China)　　Abstract：  Objective  To summarize the effects of Aspirin on growth proliferation and metastasis potential in human colorectal cancer cell line SW480.  Methods  Different dosages of Aspirin (2.5，5.0，10.0 mmol/L) were used to intervene human colorectal cancer cell line SW480 in vitro.A growth curve and a MTT colorimetric method were used to survey the cell growth proliferation，an in vitro metastasis assay was used to investigate the cell metastasis potential.Metastasis related gene，CD44v6 and nm-23 were detected by using immunocytochemistry.  Results  Aspirin could inhibit the growth of SW480 cells，decrease the metastasis potential by inhibiting the cell infiltrating into matrigel membrane，down-regulate the protein level of CD44v6，but up-regulate nm-23 expression in a dose and time-dependent manner.The inhibiting cell growth rate reached to 14.5%～91.8%.  Conclusion  Aspirin can inhibit the growth of colorectal cancer cell line SW480 and metastasis potential as well，down-regulation the protein level of CD44v6 and up-regulation the protein level of nm-23 may be one of the molecular mechanisms of anti-tumor of Aspirin.    Key words：  Aspirin; colonic neoplasms; neoplasm metastasis; neoplasm invasiveness　　结肠癌是一种常见的恶性肿瘤，在发达国家位居肿瘤相关死亡原因的前列，而结肠癌转移特别是肝转移和腹腔转移是影响其预后的最主要原因，目前尚缺乏有效的防治办法。流行病学研究显示［1～4］阿司匹林可降低大肠癌的发病率，临床上尚发现其可减少或消退结肠息肉［5，6］。实验表明［7］阿司匹林可减少实验动物结肠肿瘤的发生，并通过抑制COX -2，减少前列腺素类物质以及前血管形成因子（proangiogenic factors）的产生，抑制肿瘤的转移。为进一步探讨阿司匹林预防/治疗结肠肿瘤的机理，笔者观察了阿司匹林对COX-2阴性的结肠癌细胞株SW480生长增殖及与肿瘤转移密切相关的细胞表面粘附分子CD44v6及抑癌基因nm-23的变化，并通过体外实验了解阿司匹林对肿瘤细胞侵袭能力的影响，旨在为阿司匹林抗肿瘤机理的研究进一步提供理论依据。1  材料与方法　　1.1  材料        大肠癌细胞株SW480从美国纪念斯隆-凯特林癌症中心引进，由武汉大学典型生物保藏中心提供，单层贴壁生长，集落形成率为40%，裸鼠致瘤性100%。RPMI1640培养液及小牛血清购自GIBCO公司。阿司匹林购自Sigma 公司，溶于DMSO配制成母液。氮蓝四唑盐（MTT）购自AMRESCO公司。抗CD44v6、nm-23抗体均为小鼠抗人CD44v6、nm-23单克隆抗体，购自武汉博士德生物公司。Boyden侵袭小室购自江苏海门麒麟医用仪器厂。硝酸纤维素滤膜购自北京原平皓生物技术公司。matrigel胶为Becton Dickinson产品，由北京医科大学细胞生物学系惠赠。　　1.2  方法　　1.2.1  细胞培养  结肠癌细胞株SW480常规培养于含有10%小牛血清，50IU/ml青霉素和50mg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，在37℃，5%CO2培养箱中贴壁培养。　　1.2.2  体外细胞增殖抑制实验  采用生长曲线法和四甲基偶氮唑盐实验（MTT）法。　　1.2.2.1  生长曲线法  取生长状态良好的SW480细胞，用0.25%胰酶消化制成细胞悬液，以1×105个细胞/孔接种于96孔培养板内，加培养基使每孔总体积达200μl。常规培养24h后，每孔加入阿司匹林母液，使其终浓度分别为0、2.5mmol/L、5.0mmol/L、10.0mmol/L，即对照、低、中、高浓度药物组，每组24孔。继续置于37℃含5%CO2的培养箱中培养7天，以后每天每组取3孔测细胞数，分别计算均值，以培养时间为横轴、细胞数为纵轴绘制生长曲线。　　1.2.2.2  四甲基偶氮唑盐实验（MTT）法  实验设计同生长曲线法，即阿司匹林干预设0、2.5mmol/L、5.0 mmol/L、10.0 mmol/L（即对照、低、中、高浓度实验组）共4组。取对数增长期细胞1×105个接种于96孔培养板内，每组3个复孔。置于37℃，5%CO2培养箱中培养，24h后分别加入不同浓度阿司匹林，总体积200μl，继续培养1～7天，每天换培养基并保持药物浓度。每天每组取3孔进行MTT实验。测定时在培养孔内加入1mg/ml MTT工作液培养4h，弃上清，加入100μl DMSO溶液，自动酶标仪于570nm波长下测定OD值。按下列公式计算抑制率：    抑制率（IR）（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。　　1.2.3  CD44v6及nm-23免疫细胞化学染色  生长于玻片上的SW480细胞受不同浓度的阿司匹林干预72h后，冷丙酮固定，纯甲醇加双氧水灭活内源性过氧化物酶，抗原修复液I修复抗原，SABC法染色，DAB显色，苏木素轻度复染，常规脱水、透明、封片，观察结果。采用PBS代替一抗作阴性对照。阳性染色呈弥漫性棕黄色或散在的棕黄色颗粒，位于癌细胞膜和细胞浆中，阴性对照为蓝色。应用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像免疫组化测量系统对每张细胞片随机检测5个视野下阳性细胞的吸光度值（OD），取其平均值作为CD44v6、nm-23表达的相对含量。　　1.2.4  体外侵袭实验  采用Boyden小室体外侵袭法，根据参考文献［8］介绍的方法进行。即对数生长期细胞以0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，用无血清培养液RPMI1640漂洗，调整细胞数为5×105/ml。收集细胞的培养液（无血清培养24h的培养基）0.2ml，置入Boyden小室的下室作为趋化因子。将直径为13mm，孔径为8mm的硝酸纤维素滤膜表面铺以1mg/ml的matrigel，冻干置入Boyden小室上下室之间。将上述细胞悬液0.4ml（相当于 2×105个细胞）加入Boyden小室上室中，同时加入阿司匹林母液使阿司匹林的终浓度分别为0、2.5 mmol/L、5.0mmol/L、10.0mmol/L。Boyden小室放入37℃、5%CO2培养箱内培养过夜，取出滤膜，甲醛固定5min，HE染色。200倍光镜下计数膜背面侵袭的细胞数，计数中间及四周5个视野，计算平均值，每组计数3个样本。　　1.3  统计学处理  计量数据以x±s表示，组间比较采用t检验。2  结果　　2.1  阿司匹林对SW480细胞生长增殖的影响  如图1所示，阿司匹林对SW480具有较强的抑制作用，其抑制作用随浓度增加和时间延长而增大，呈典型的浓度及时间依赖关系。在观察的药物浓度和时间范围内，其抑制率最低为14.5%，最高为91.8%。　　2.2  阿司匹林对结肠癌细胞株SW480 CD 44v6、nm-23表达的影响  结果见表1和图2。从表1显色反应的光密度扫描结果看，各种浓度的阿司匹林作用后，CD44v6的光密度下降，nm-23的光密度增加，与对照组相比差异均具有高度显著性（P均<0.01），但增加药物浓度并未能进一步减弱或增强其表达。图2显示SW480细胞未受到药物作用时，CD44v6呈较强阳性表达，但给予阿司匹林后，表达减弱，表明阿司匹林抑制CD44v6的表达。nm-23蛋白在未受到药物作用的SW480中呈弱阳性表达，表现为胞浆染淡黄色，给予阿司匹林后，此基因蛋白的阳性显色明显增强，表明阿司匹林诱导了nm-23基因蛋白的表达。　　表1  阿司匹林对SW480细胞CD44v6及nm-23蛋白表达的显色反应光密度的影响（略）　　与对照组比较，a：t=17.32，b：t=20.78，c：t=20.78，d：t=17.32，e：t=13.86，f：t=17.32，P均<0.01　　图1  阿司匹林对SW480细胞生长增殖的影响（略）　　A  SW480细胞CD44v6   呈强阳性表达（×400）      B  阿司匹林（5mmol/L）作用   后CD44v6表达减弱（×400）      C  SW480细胞   nm-23表达（×200）      D  阿司匹林（5mmol/L）作用   后nm-23表达增强（×400）　　图2  阿司匹林对 SW480细胞CD44v6及nm-23蛋白表达的影响的免疫细胞化学染色（略）　　2.3  阿司匹林对SW480细胞转移侵润能力的影响  体外侵袭实验结果示，阿司匹林浓度分别为2.5mmol/L、5.0mmol/L、10mmol/L时，SW480侵袭的细胞数分别为94.2±9.2、51.4±6.7、15.7±3.6，与空白对照组(165.3±10.8)比较，t值分别为8.68、15.52、22.76，P均<0.01，见图3。提示给予阿司匹林后能明显削弱SW480穿过滤膜的能力，这种作用随着阿司匹林浓度增大而增强（P<0.01），呈浓度依赖关系，表明阿司匹林具有降低SW480细胞转移侵袭的作用。　　图3  阿司匹林对SW480细胞转移侵润能力的影响（略）3  讨论    流行病学资料显示［1～4］，长期服用非甾体类消炎药（NSAID）可降低大肠癌的发生率，动物实验和体外细胞培养也显示［9，10］NSAID能抑制结肠癌细胞株的生长增殖，临床还发现NSAID对腺瘤性结肠息肉具有消退作用［5，6］。有关NSAID预防/治疗结肠肿瘤的机理还未完全阐明，以往研究普遍认为NSAIDs是通过抑制COX-2而发挥抗肿瘤作用，但并非所有结肠肿瘤细胞均表达COX-2，NSAIDs对COX-2表达阴性的肿瘤细胞作用如何报道尚少。我们应用COX-2阴性的结肠癌细胞株SW480做为实验模型，结果显示，阿司匹林具有抑制SW480细胞生长增殖的作用，在我们观察的药物浓度和时间范围内，其抑制率最高达91.8%，与国外学者的研究结果相似［11］，诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期于G0/G1期是其作用机理之一（另文报道），本实验也证实了阿司匹林抑制肿瘤细胞生长增殖通过了非COX-2依赖途径［12］。    转移是恶性肿瘤最主要的生物学特性之一，也是影响结肠癌预后的最主要因素。本研究还发现，阿司匹林具有降低CD44v6蛋白但促进nm-23蛋白的表达，明显降低SW480细胞穿透matrigel膜的能力，此效应与阿司匹林呈浓度依赖关系。众所周知，癌转移与肿瘤细胞的粘附性、降解细胞外间质(ECM)和移动能力有关。CD44v6是一个与肿瘤转移关系密切的细胞粘附分子［13，14］，能与ECM及基底膜的透明质酸结合，调节细胞的形态及运动，启动血管的发生，使肿瘤易进入淋巴系统和循环系统，为侵润转移奠定基础。已证明，CD44v6过量表达与结肠癌、胃癌、食管癌及恶性黑素瘤等许多肿瘤的发生发展，侵润转移及预后不良密切相关［15，16］。而nm-23是一个编码核苷二磷酸激酶（NDPK）的抑癌基因，可在多个层次上影响肿瘤细胞的生物学行为包括抑制癌转移功能。临床以及实验研究证实，nm-23基因表达水平与人类肿瘤如大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌及肺癌等的转移能力及临床预后不良呈负相关［17～19］，通过药物诱导nm-23 mRNA及蛋白的表达［20］以及调控细胞表面粘附分子可以抑制肿瘤转移［21］。本研究发现阿司匹林明显降低SW480细胞穿透matrigel膜的能力，反映了细胞侵袭能力的下降，我们认为，阿司匹林诱导细胞凋亡或死亡，导致细胞丧失活力外（另文报道），抑制细胞粘附分子CD44v6，促进抑癌基因nm-23蛋白等与细胞转移侵润相关基因的表达也可能是其作用机理之一。【参考文献】　［1］ Thun MJ，Namboodiri MM，Calle EE，et al.Aspirin use and risk of fatal cancer ［J］.Cancer Res，1993，53(6)：1322-1327.　［2］ International Agency for Research on Cancer.IARC Handbooks of Cancer Prevention.Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs ［M］，1997.1-202.　［3］ Garcia Rodriguez LA，Huerta-Alvarez C.Reduced incidence of colorectal adenoma among long-term users of nonsteroidal antiinflammatory drugs： a pooled analysis of published studies and a new population-based study ［J］.Epidemiology，2000，11(4)：376-381.　［4］ Garcia Rodriguez LA，Huerta-Alvarez C.Reduced risk of colorectal cancer among long-term users of aspirin and nonaspirin nonsteroidal antiinflammatory drugs ［J］.Epidemiology，2001，12(1)：88-93.　［5］ Kawamori T，Rao CV.Seibert K，Reddy BS.Chemopreventive activity of celecoxib，a specific cyclooxygenase-2 inhibitor against colon carcinogenesis ［J］.Cancer Res，1998，58(3)：409-412.　［6］ Oshima M，Dinchuk JK，Kargman SL，et al.Suppression of intestinal polypsis in ApcΔ716 knockout mice by inhibition of cyclooxygenase 2(Cox-2) ［J］.Cell，1996，87(5)：803-809.　［7］ Tsujii M，Kawano S，Tsuji S，et al.Cyclooxygenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells ［J］.Cell，1998，93(5)：705-716.　［8］ 高进.癌的侵袭与转移——基础与临床［M］.北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1996.1.　［9］ Craven PA，DeRubertis FR.Effects of aspirin on 1，2-dimethylhydrazine-induced colonic carcinogenesis ［J］.Carcinogenesis，1992，13(4)：541-546.　［10］ Reddy BS，Rao CV，Rivenson A，et al.Inhibitory effect of aspirin on azoxymethane-induced colon carcinogenesis in F344 rats ［J］.Carcinogenesis，1993，14(8)：1493-1497.　［11］ Subbegowda R，Frommel TO.Aspirin toxicity for human colonic tumor cells results from necrosis and is accompanied by cell cycle arrest ［J］.Cancer Res，1998，58(13)：2772-2776.　［12］ Goel A，Chang DK，Ricciardiello L，et al.A novel mechanism for aspirin-mediated growth inhibition of human colon cancer cells ［J］.Clin Cancer Res，2003，9(1)：383-390.　［13］ Gunthert U，Hofmann M，Rudy W，et al.A new variant of glyxoprotein CD44v6 Confers metastatic potential to rat carcinoma cell ［J］.Cell，1991，65(1)：13-24.　［14］ Rall CJ，Rustgi AK.CD44 isoform expression in primary and matastatic pancreatic adenocarcinoma ［J］.Cancer Res，1995，55(9)：1831-1835.　［15］ Xin Y，Zhao FK，Zhang SM，et al.Relationship between CD44v6 expression and prognosis in gastric carcinoma patients ［J］.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi，1999，7：210-214.　［16］ Indinnimeo M，Cicchini C，Giamieri E，et al.Evaluation of CD44 variant 6 expression and clinicopathological factors in pulmonary metastases from colon carcinoma ［J］.Oncol Rep，2003，10(6)：1875-1887.　［17］ Steeg PS，Bevilacqua G，Kopper L，et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential ［J］.J Natl Cancer Inst，1988，80(3)：200-204.　［18］ Tannapfel A，Kocherling F，Katalinic A.Expression of nm23-H1 predicts lymph node involvement in colorectal carcinoma ［J］.Dis Colon Rectum，1995，38(6)：651-655.　［19］ 余保平，王伟岸，于皆平，等.nm23-H1表达预测大肠癌转移的价值研究［J］.肿瘤防治研究，2000，27（2）：103-104.　［20］ 毛海婷，张玲，王芸，等.淫羊藿甙和济南假单胞菌制剂调控PG细胞转移相关基因的表达［J］.肿瘤，2000，20（1）：13-15.　［21］ 罗利群，张友会，黄兰青，等.干扰素对小鼠乳腺癌细胞侵袭力及转移相关基因表达的调变［J］.中华肿瘤杂志，1997，19（3）：184-187.