异十三基二胺体内外抗肿瘤作用
发表时间：2009-11-19 浏览次数：577次
异十三基二胺体内外抗肿瘤作用作者：王瑞幸, 黄循铷, 吴枝娟, 吴国土, 林菁 【关键词】 抗肿瘤药;,肿瘤细胞,培养的;,肿瘤移植;,异十三基二胺 摘要: 目的 观察异十三基二胺(D79)的体内外抗肿瘤作用。 方法 应用锥虫蓝排染法、MTT法检测D79对多种体外培养肿瘤细胞的细胞毒作用;Bliss法观察D79急性毒性实验;在可耐受剂量下观察D79对小鼠移植性实体瘤U14、腹水瘤EAC、HAC的抑制率。 结果 D79显著杀伤多种体外肿瘤细胞,药物作用48 h,IC50 1.24~3.36 μg/mL;D79的LD50为36.49 mg/kg(静脉注射)。D79抑制小鼠移植性实体瘤U14体内生长、提高移植性腹水瘤EAC、HAC小鼠生存时间的作用呈剂量依赖性。 结论 D79有较强的体内外抗肿瘤作用。 关键词: 抗肿瘤药; 肿瘤细胞,培养的; 肿瘤移植; 异十三基二胺 Antitumor Activity of Allotritridecyldiamidogen in vivo and in vitro Wang Ruixing, Huang Xunru, Wu Zhijuan, Wu Guotu, Lin Jing 1.Division of Physiology and Pathophysiology, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China 2.Department of Gastroenterology, The Affilicated First Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China 3.Division of Pharmacology, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China ABSTRACT: Objective To observe the antitumor effect of allotritridecyldiamidogen(D79) in vivo and in vitro. Methods The cytotoxic effects of D79 on various tumor cells lines cultured in vitro were determined by trypan blue dye exclusion test, MTT method . Acute toxicity of D79 was evaluated by Bliss method: at a tolerable dose level, D79 was administrated to treat transplanted solid tumor U14 and ascetic tumors EAC and HAC. Tumor weight inhibition and life extension were observed. Results D79 induced significant growth arrest in various malignant tumor cell lines cultured in vitro. IC50 of these tumor cells exposed to the drug for 48 hours ranged from 1.24~3.36 μg/mL. LD50 of D79 was 36.49 mg/kg(mice, iv). D79 inhibit in vivo growth of implanted solid tumor U14 and prolonged live time implanted ascetic tumors EAC and HAC of mice in a dosedependment manner. Conclusion D79 had obvious antitumor activity in vivo and in vitro. KEY WORDS: antineoplastic agents; tumor cells,cultured; neoplasms transplantation; allotritridecyldiamidogen 2000年,Yang等证实末端支链饱和脂肪酸13甲基肉豆蔻酸(13MTD)体内外抗肿瘤作用并发现其主要通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用[1]。异十三基二胺(D79)是在13MTD基础上合成的一种新型胺类化合物,其化学结构明显区别于当前常规抗肿瘤药物。笔者研究其体内外抗肿瘤作用,初步结果报告如下。1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 药品 2%D79溶液(福建省振华851生物制药有限公司,批号040507);RPMI 1640培养基干粉(美国Gibco公司);小牛血清(美国HyClone公司);胰蛋白酶(美国Difco公司);锥虫蓝及噻唑蓝(MTT,美国Sigma公司);环磷酰胺(上海华联制药厂生产,批号040202);氟尿嘧啶(250 mg/10 mL,天津金耀氨基酸有限公司,批号0501182);其余试剂均为国产分析纯。 1.1.2 仪器 6孔及96孔细胞培养板(美国Coster公司);生物安全柜(HFSafe1200型)及气体培养箱(BB5060,上海力申科学仪器有限公司);全自动酶标仪(Mod550,美国BioRad公司);倒置显微镜及正置显微镜(日本Olympus公司);微量称质量仪(BP221S,德国Sartorius公司);电子天平(TD6001B,余姚市金诺天平仪器有限公司);振荡器(2002型,常州国华电器有限公司)。 1.1.3 动物及瘤株 昆明种小鼠,体质量(20±2)g,雌雄不限,由福建医科大学实验动物中心(合格证号:医动字2306号)。每次实验使用同一性别小鼠。小鼠子宫颈癌实体型瘤株(U14)、小鼠艾氏腹水瘤(EAC)及肝癌腹水瘤(HAC)均引自福建医科大学药学系。 1.1.4 肿瘤细胞 人慢性粒细胞白血病细胞株(K562)、人早幼粒白血病细胞株(HL60)、小鼠黑色素瘤细胞株(B16)、人肝癌细胞株(HEPG2)、人胃腺癌细胞株(SGC7901)均引自福建医科大学药学系。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 K562、HL60、B16、HEPG2、SGC7901细胞株培养于含10%小牛血清、青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL的RPMI1640培养液中,每3天换液一次,每5天传代一次。细胞均置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2,饱和湿度的气体培养箱中。 1.2.2 锥虫蓝排染法 取对数生长期的HL60、K562细胞,以全培养液稀释成5×104mL1单细胞悬液,接种于96孔细胞培养板,每个浓度复种4孔,每孔190 μL,置于气体培养箱培养。12 h后D79组每孔加不同浓度D79 10 μL,对照组加等量溶剂。共培养48 h后每孔加0.4%锥虫蓝100 μL,染色5 min。计数各组拒染活细胞数,按下式计算抑制率： 抑制率%=(1药物组活细胞数/对照组活细胞数)×100%直线回归法测该药的半数抑制浓度(IC50)。实验重复3次[2]。 1.2.3 MTT法 取对数生长期的B16、HEPG2、SGC7901细胞,0.25%胰酶PBS液消化后,全培养液稀释成5×104mL1单细胞悬液,接种于96孔细胞培养板,每个浓度复种4孔,每孔190 μL。置于气体培养箱内,12 h后D79组每孔加不同浓度D79 10 μL,对照组加等量溶剂,共培养48 h。反应结束前4 h每孔加入MTT(1 mg/mL)50 μL。继续培养4 h,吸尽上清,每孔加入DMSO 200 μL充分溶解MTT还原产物。酶标仪550 nm检测光密度(Dλ)并计算抑制率。直线回归法计算IC50。实验重复3次[2]。 抑制率%=[1药物组D(550 nm)值/对照组D(550 nm)值]×100% 1.2.4 D79急性毒性实验 根据文献[3]方法,小鼠静脉注射(iv)不同剂量D79,连续观察7 d。 1.2.5 小鼠移植性肿瘤接种及传代 1.2.5.1 U14实体瘤接种传代[4] 取肿瘤生长旺盛的小鼠,无菌操作摘取实体肿瘤,称质量,按1∶4比例加入无菌生理盐水,磨成匀浆,取0.2 mL接种于小鼠右腋部皮下。 1.2.5.2 EAC、HAC腹水瘤接种传代[4] 取肿瘤生长旺盛的小鼠,无菌操作抽取腹水,称体积后按1∶4比例加入无菌生理盐水,取0.2 mL接种于小鼠腹腔内。 1.2.6 D79对小鼠移植性肿瘤的抑制作用 根据急性毒性实验结果,选择3个剂量(10.0,7.0,4.9 mg?kg1?d1)连续腹腔注射(ip)。接种肿瘤后按体质量随机分组,设阴性对照组、阳性对照组及D79组。阳性对照组给予环磷酰胺或氟尿嘧啶[1，3],阴性对照组给予等量溶剂,D79组按给予剂量分为高、中、低剂量组;于接种当日开始给药(ip),连续10 d。U14荷瘤小鼠于实验第12天取瘤称质量,计算瘤质量抑制率。EAC、HAC荷瘤小鼠记录实验小鼠生存时间,并计算生命延长率。 瘤质量抑制率%=(1药物组平均瘤质量/阴性对照组平均瘤质量)×100% 生命延长率%=(药物组平均生存时间/阴性对照组平均生存时间1)×100% 1.3 统计学处理 数据以x±s表示。采用SPSS 11.5统计软件处理,差异显著性检验采用方差分析。2 结 果 2.1 D79对多种肿瘤细胞的体外细胞毒作用 D79 0.25~4.00 μg/mL作用48 h,对多种体外培养肿瘤细胞均产生显著杀伤作用,抑制率随药物剂量的增加而升高,IC50 1.24~3.36 μg/mL(表1)。表1 D79对肿瘤细胞的体外细胞毒作用（略） 2.2 D79小鼠急性毒性实验 小鼠ivD79后未发现明显异常。死亡小鼠解剖观察主要脏器未发现明显异常。D79急性毒性实验结果见表2。表2 小鼠静脉注射D79急性毒性实验（略） 2.3 D79对小鼠移植性肿瘤U14的抑制作用 结果见表3。表3 D79对小鼠移植性肿瘤U14的抑制作用（略） 2.4 D79对小鼠移植性肿瘤EAC、HAC的抑制作用 结果见表4。表4 D79对小鼠移植性肿瘤EAC、HAC的抑制作用（略）3 讨 论 恶性肿瘤是本世纪人类面临最大威胁的疾病之一。目前临床常用抗肿瘤药物广泛存在对肿瘤选择差、毒副作用大以及易产生耐药性等缺点，因此,寻找疗效好、毒副作用小的新型抗肿瘤药已成为人类战胜恶性肿瘤的当务之急。D79是在13MTD基础上合成的一种新型胺类化合物,其化学结构明显区别于当前常规抗肿瘤药物[5],因此可能不易与临床常规抗肿瘤药物发生交叉耐药。 13MTD对多种体外培养肿瘤细胞具有杀伤作用,抑制裸鼠原位移植人前列腺癌细胞株及肝癌细胞株肿瘤的生长,其体内外抗肿瘤作用主要通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用[1]。本实验中,D79对K562、HL60、B16等5种体外培养肿瘤细胞均有显著杀伤作用,并且作用呈剂量依赖性。对人早幼粒白血病细胞株HL60最敏感,对人肝癌细胞株HEPG2最不敏感,平均IC50在1.24~3.36 μg/mL。D79小鼠急性毒性实验结果Bliss法计算LD50=36.49 mg/kg(iv),其LD95是32.34~41.18 mg/kg(iv)。D79在可耐受剂量下,其对小鼠移植性宫颈癌U14实体瘤和肝癌HAC及EAC腹水瘤亦有明显的剂量依赖性抑制作用。D79体内外抗肿瘤作用明显强于13MTD[1]。D79是在13MTD基础上合成的一种新型胺类化合物,因此笔者推测D79可能亦通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。 D79有较强的体内外抗肿瘤作用,有望成为一种广谱、强效、毒性小的新型抗肿瘤药物,笔者将进一步研究其抗肿瘤作用机制。参考文献： [1] Yang ZH,Liu SP,Chen XD,et al. Induction of apoptotic cell death and in vivogrowth inhibition of human cancer cells by a saturated branchedchain fatty acid 13methyltetradecanoic acid[J]. Cancer Res, 2000,60(3):505509. [2] 林心建,黄自强,李常春. 洋地黄毒甙体外抗人癌细胞株的作用[J]. 福建医学院学报, 1996,30(1):1718. [3] 徐叔云,卞如濂,陈 修. 药理实验方法学[M]. 2版. 北京:人民卫生出版社, 1991:201206. [4] 吴国土,林建忠,王瑞幸,等. 桂苓散的抗癌作用[J]. 福建医科大学学报, 2003,37(1):8991. [5] 潘启超,胥 彬. 肿瘤药理学与化学治疗学[M]. 2版. 郑州:河南医科大学出版社, 2000:99325.
