βCatenin， cyclinD1及cmyc在肝细胞癌中的表达

【摘要】  目的 探讨βCatenin、cyclinD1及cmyc 蛋白的表达与肝癌临床病理参数的关系。方法 采用EnVisionTM plus免疫组织化学方法研究βCatenin、cyclinD1及cmyc蛋白在52例HCC及癌旁肝组织中的表达情况。结果 52例HCC中βCatenin、cyclinD1及cmyc 蛋白染色阳性率分别为55.8%、48.1%及53.8%，癌旁肝组织的阳性率为36.5%、25.0%及32.7%，βCatenin、cyclinD1及cmyc在HCC及癌旁肝组织两者间有显着性差异(P<0.05)。 在HCC中βCatenin的阳性表达与cyclinD1、cmyc的阳性表达密切相关（Ｐ=0.0108, r=0.3920；Ｐ=0.0295, r=0.3406）且呈正相关；βCatenin、cyclinD1及cmyc在人肝癌组织中的检出率与肝外转移、术后复发及肿瘤分化程度明显有关（Ｐ<0.05），cyclinD1的检出率与门静脉癌栓也明显有关（Ｐ<0.05），βCatenin的检出率与临床分期和门静脉癌栓也有显著性差异（Ｐ<0.05）。结论 βCatenin、cyclinD1及cmyc蛋白的过表达可促使肝癌细胞增殖,使肝癌细胞具有更强的侵袭力，与肝癌的发生发展关系密切。

【关键词】  肝细胞癌 βCatenin cyclinD1 cmyc 免疫组织化学

　　0  引言    　　β连环蛋白(βCatenin)是一种重要的胞内蛋白，是Wnt信号转导通路中致癌的关键分子，其降解障碍致使胞质内游离的βCatenin积累，通过与Tcf／lef结合进入胞核，激活下游靶基因cmyc和cyclinD1等的转录，引起细胞增殖和分化失控，导致肿瘤发生[1]。   βCatenin也是构成粘附连接的Ecad／catenin复合体的胞内重要成分。其异常改变可导致的整个复合体结构破坏与功能障碍，在肿瘤浸润、转移过程中发挥重要作用[2]。  我们用免疫组织化学方法检测βCatenin、cyclinD1及cmyc基因在HCC及癌旁肝组织中的表达，探讨三者表达与其他临床病理参数之间的关系。

　　1  资料与方法

　　1.1  临床资料    　　收集1999年6月～2003年2月广西医科大学附属肿瘤医院手术切除的肝癌及癌旁肝组织标本52例，患者男性35例，女性17例；年龄20～67岁，中位年龄46.5岁。患者术前均未进行任何抗癌治疗，每例均在术中取肝癌及癌旁肝组织。所有病例均经HE染色证实为HCC。病理分级为I级19例、II级17例、III级15例、IV级1例。术前检测AFP(+)29例(注：AFP≥400ng/ml为阳性)、AFP(-)23例，HBsAg(+)50例、HBsAg (-)2例；TSGF(+)40例 (注：TSGF≥64 U/L为阳性)、TSGF(-)12例，临床分期Ⅰ、Ⅱ期者34例，Ⅲ期18例。cyclinD1及cmyc单克隆抗体购自美国Zymed公司, βCatenin单克隆抗体购自美国Lab VisionNeo Markers公司；即用型非生物素免疫组化EliVisionTM  plus检测试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。

　　1.2  方法

　　1．2．1  βCatenin、cyclinD1及cmyc的免疫组化检测    　　标本常规用10%甲醛固定、石蜡包埋，制成4μm连续切片后，进行免疫组化EliVisionTM  plus法染色，主要步骤如下：切片脱蜡至水，高压修复1.5min，阻断内源性过氧化物酶20min，正常非免疫血清封闭30min，滴加Ⅰ抗在室温孵育1h，滴加50μl聚合物增强剂A，室温孵育20min；滴加50μl酶标抗鼠/兔聚合物B，室温孵育30min；新鲜DABH2O2溶液显色，苏木精复染。以已知阳性反应片作阳性对照，阴性对照采用PBS替代Ⅰ抗进行同步染色。

　　1．2．2  临床随访观察    　　所有病例术后进行常规的放疗和（或）化疗，并进行追踪随访１年。每个月电话或信访，每月定期复查肝功能及AFP、TSGF，术后每隔3个月复查CT，了解有无复发，术后1年了解生存情况。52例患者中50例有随访资料，其中14例在随访半年出现复发，12例在随访1年死亡。

　1．2．3  结果判定    　　染色结果观察采用双盲法，由两位病理科医生在不知病理分级与临床资料的情况下读片，每个切片察五个视野（400倍）计算阳性细胞数，计算总细胞数不少于1 000个，按阳性细胞所占百分数分为：阳性细胞率<5%为阴性（-）；5%～24%为弱阳性（+）；25%～50%为阳性（++）；>50%为强阳性（+++）。

　　1.3  统计学分析    　　用SPSS10.0软件进行χ2检验；相关分析采用Pearson法，P<0.05为有显著性差异。

　　2  结果

　　2.1  βCatenin、cyclinD1及cmyc 蛋白的表达情况    　　βCatenin蛋白表达在癌组织中表现为细胞质或核内沉积，而在癌旁组织主要表现为均匀分布于细胞膜，仅极个别标本中有胞质极弱着色，细胞核无染色。肝癌标本βCatenin蛋白阳性染色占55.8%(29/52)，而癌旁肝组织阳性率为36.5%(20/52)，组间有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。    　　cyclinD1阳性染色定位于细胞核中，阳性细胞染色呈散在或片状分布。HCC中48.1%(25/52)呈阳性表达，而癌旁组织中明显低，仅25.0%(13/52)，组间有明显差异(P<0.05)， 见表1、图2。    　　cmyc蛋白定位于细胞浆内, 呈弥漫性分布。在HCC中53.8%(28/52)为阳性表达，癌旁组织中阳性为32.7%(17/52)，组间有显着性差异(Ｐ<0.05)，见表1、图3。

　　表1  βCatenin、cyclinD1及cmyc 蛋白在肝癌组织及其癌旁肝组织中的表达（略）

　　*P<0.05

　　2.2  βCatenin、cyclinD1及cmyc在HCC表达间的相关性    　　在肝癌组织中βCatenin的阳性表达与cyclinD1的阳性表达密切相关（P=0.0108, r=0.3920）,与cmyc的阳性表达也密切相关（Ｐ=0.0295, r=0.3406），呈正相关，见表2。

　　2.3  βCatenin、cyclinD1及cmyc的表达及与其他临床病理参数关系    　　52例肝细胞癌病人按临床分期、有无门静脉癌栓及肝外转移、有无术后复发、肿瘤直径、血清AFP水平、血清TSGF水平、HBsAg状况以及肿瘤分化程度（按照Edmondson法分级）等进行分组。由表3可见，βCatenin、cyclinD1及cmyc在人肝癌组织中的检出率都与肝外转移、术后复发及肿瘤分化程度明显有关（P<0.05），βCatenin和cyclinD1的检出率与门静脉癌栓也明显相关（P<0.05），βCatenin、cyclinD1及cmyc的检出率与肿瘤大小、肿瘤个数、血清AFP水平、血清TSGF水平、HBsAg状况都无明显关系。

　　图1  βCatenin在HCC中的阳性表达 （EnVision×400）（略）

　　图2  βCatenin在癌旁肝组织的表达 （EnVision×400）（略）

　　图3  cyclin D1在HCC中的阳性表达 （EnVision×400）（略）

　　图4  cyclin D1在癌旁肝组织的表达 （EnVision×400）（略）

　　图5  cmyc在HCC中的阳性表达  （EnVision×400）（略）  

　　图6  cmyc在癌旁肝组织的表达 （EnVision×400）（略）

　　表2  βCatenin与cyclinD1、cmyc在HCC表达间的相关性（略）

　　*P<0.05

　　表3  βCatenin cyclinD1及cmyc在肝癌组织中表达与临床病理参数关系（略）

　　*P<0.05　　　　3  讨论    　　肝细胞癌的发病机制是目前人们研究的重点之一。 术后转移复发是原发性肝癌手术治疗的难点（术后复发率高达60.8％），   严重影响临床疗效[3,4]。     　　在许多肿瘤中可以检测到βCatenin基因第3外显子突变及其蛋白在胞质的异常表达。βCatenin在细胞粘附和WNT信号传导两个过程发挥作用，无功能的βCatenin在细胞过度沉积导致细胞内游离βCatenin水平升高，细胞过度增生[5]。我们发现βCatenin表达在原发灶中表达明显高于癌旁肝组织。原发灶中βCatenin表达与门静脉癌栓、肝外转移、术后复发和临床分期明显有关，提示βCatenin在原发灶形成和肿瘤细胞转移到门脉内继续增生都有促进作用。转移灶中有βCatenin异常表达，参与癌栓形成过程中多个环节：粘附松散，脱离复发灶，到达转移部位的增生和粘附两方面发挥作用，通过两个途径促进肝内播散。

　Qiao等[6]研究胰腺导管癌中βCatenin的表达状态，发现胞膜染色减少者25例(58．1％)，28例呈胞质染色(65．1％)，二者均与cyclin D1高表达明显相关，提示βCatenin基因主要通过激活cyclin D1转录而参与胰腺癌的发生。cyclinD1基因扩增是多种肿瘤中过表达的常见原因，cyclinD1在大肠癌、肝细胞癌中的基因扩增和(或) 高表达已有一些报道[7,8]。我们发现原发灶和癌旁组织中cyclinD1表达不同，原发灶中表达明显高于癌旁肝组织。原发灶中cyclinD1表达与门静脉癌栓、肝外转移、术后复发及肿瘤分化程度明显相关，提示cyclinD1对原发灶形成和肿瘤细胞转移到门脉内继续增生都有促进作用。这与文献[9]报导一致。在低分化的HCC中cyclinD1蛋白表达升高, 表明cyclinD1阳性表达率越高,组织学分化越差,cyclinD1与HCC 进展有关系。    　　cmyc和cyclinD1是WNT通路中的核心环节[10，11]， 共同影响肝癌的发展。 具有转录因子活性的cmyc蛋白在G n5期表达最明显， 活化后具有促进增殖和凋亡的双向作用。 较多的研究表明cmyc的持续刺激可引起肝细胞的增殖和选择性转化导致肝癌发生[12]。 本研究结果显示肝癌的阳性表达明显高于癌旁肝组织， 尤其在巢周癌细胞和癌旁肝硬化细胞中,  这类细胞正是增殖活跃的细胞群体； 这种表达特性可能提示在该类细胞中存在某种相同的刺激因素,  致使cmyc原癌基因活化并持续表达,  有利于细胞增生与癌变,特别是癌旁肝硬化结节中的细胞是具有高度癌变倾向的癌巢周细胞， 同时具有浸润转移能力,与肝细胞的恶性转化密切相关。     　　我们在研究βCatenin表达、cyclinD1基因扩增和cmyc表达的相关性时发现，βCatenin的阳性表达与cyclinD1、cmyc的阳性表达密切相关（Ｐ=0.0108, r=0.3920；Ｐ=0.0295, r=0.3406），呈正相关。βCatenin作为WNT通路中的关键环节，并非单一上下游的线性运行[13]，与其他信号信道可能相互影响，从而形成复杂的网络效应，提示βCatenin异常表达在肿瘤发展过程中有多重效应[14]。本研究提示在肝外转移、术后复发及肿瘤分化程度都与βCatenin、cyclinD1与cmyc的异常表达有关，可能是βCatenin与其他癌基因协同作用的结果，因而βCatenin异常表达进一步影响肿瘤临床病理参数。    　　对上述环节的分子生物学治疗可能会阻止门脉癌栓的形成，可以作为开展分子生物学治疗的靶点。但体内WNT信号传递网络的复杂性和细胞周期调控的精确机制不是βCatenin、cyclinD1和cmyc能完全解释的，在HCC 发病的多个步骤中发挥作用,而作用的途径与机制可能有所不同。进一步研究信号传递和细胞周期调控的机制可能会给肝癌转移复发的治疗带来突破性的进展。

【参考文献】  　　［1］ Kikuchi A．Regulation of betacatenin signaling in the Wnt pathway[J]． Biochem Biophys Res Commun，2000，268（2）:243248．

　　[2] Jawhari AU，Faahing MJ，Piguatelli M．The Ecadhefin／epidermM growth factor receptor interaction： a hypothesis of reciprocal and reversible control of intercellular adhesion and cell proliferation[J]．J Pathol，1999，187（2）:155157．

　　[3] Belghiti J,Regimbeau JM,Durand F,et al．Resection of hepatocellular carcinoma:a European experience on 328 cases[J]．Hepatogastroenterology，2002,49（43）:4146．

　　[4] Kew MC.Epidemiology of hepatocellular carcinoma[J]．Toxicology，2002，181182:3538．

　　[5] Cui J,Zhou XD， Liu YK, et al. Abnormal betacatenin gene expression with invasiveness of primary hepatocellular carcinoma in China[J].World J Gastroenterol, 2001，7（4）:542546．

[6] Qiao Q，Ramadani M，Gansauge S，et a1．Reduced membranous and ectopic cytoplasmic expression of betacatenin correlate with cyclinD1 overexpression and poor prognosis in pancreatic cancer[J]． Int J Cancer，2001，95（3）:194197.

　　[7] 郭新珍，李怀斌，杨玉秀，等．TGFβ1、TβRⅡ及cyclinD1在大肠癌的表达及其意义[J]．肿瘤防治研究，2005，32（8）:3339．

　　[8] Zhang YJ, Chen SY, Chen CJ, et al．Polymorphisms in cyclinD1 gene and hepatocellular carcinoma[J]．Mol Carcinog, 2002，33（2）:125129．

　　[9] Ueta T,Ikeguchi M,Hirooka Y,et al. Betacatenin and cyclin Dl expression in human hepatocellular carcinoma[J]．Oncol Rep, 2002，9（6）:11971203．　　　　[10]Monga SP, Monga HK, Tan XF,et al.Betacatenin antisense studies in embryonic liver cultures：role in Proliferation, apoptosis, and lineage specification[J]．Gastroenterology, 2003,124（1）:202216.　　　　[11]Cui J,Zhou X,Liu YK,et al. Wnt signaling in hepatocellular carcinoma：analysis of mutation and expression of betacatenin,Tcell factor4 and glycogen synthase kinase 3beta genes[J]．J Gastroenterol Hepatol, 2003，18（3）:280287．

　　[12]Santori E,Jensen MR, Thorgeirsson SS．Disruption of the pRb/E2F pathway and inhibition of apoptosis are major oncogenic events in liver constitutively expressing cmyc and transforming growth factor alpha[J]．Cancer Res,1998，58 (1): 123134．

　　[13]Miyoshi K,Hennighausen L．betacatenin：a transforming actor 0n many stages[J]．Brest Cancer Res，2003,5（2）:6368．

　　[14]Qiang YW, Endo Y,Rubin JS, et al.Wnt signaling Bcell neoplasia[J]．Oncogene，2003，22（10）:15361545．