超抗原SEB诱导人CTL细胞杀瘤条件优化
发表时间：2009-06-24 浏览次数：647次
【摘要】 目的 通过正交设计优化CTL细胞最佳杀瘤条件。方法 补体裂解法分离CTL细胞，MTT法测定CTL细胞杀瘤活性，正交设计选择CTL细胞最佳杀瘤条件。 结果 在SEB浓度为10-6g/ml，SEB作用CTL细胞时间为24h，CTL细胞与肿瘤细胞之比为20∶1情况下CTL细胞杀瘤活性最强。 结论 CTL细胞最佳杀瘤条件组合为SEB10-6g/ml，作用时间24h，效靶比20∶1。
【关键词】 SEB CTL细胞 杀瘤效应
0 引言 细胞毒性T细胞（Cytotoxic T cell, CTL）可以直接杀伤肿瘤细胞，因此在肿瘤的生物治疗中倍受关注。SEB作为一种超抗原，能多克隆活化CTL细胞，提高CTL细胞的杀瘤效果。SEB诱导人CTL细胞杀瘤活性的研究，近年来开展较多[1]。目前超抗原能够提高CTL细胞杀瘤活性这一点已经达成共识，但如何选择CTL细胞的最佳杀瘤条件，尚未有相关报道。本文通过正交设计优化CTL细胞最佳杀瘤条件，以达到CTL细胞的最佳杀瘤效率。
1 材料与方法
1.1 材料 鼠抗人CD4、CD8单克隆抗体，酶标羊抗鼠IgG（北京中山生物技术有限公司）, MTT（sigma公司）, RPMI1640（GIBCO公司）, 淋巴细胞分离液（北京邦定泰克生物技术公司），二甲基亚砜（华美生物工程公司）, K562细胞株(中国医学科学院肿瘤医院李艳芬老师惠赠)。
1.2 方法
1.2.1 人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PMNC)分离 无菌采集健康成人外周血，加入含抗凝剂（0.1ml 250u/ml 肝素钠可抗凝血1ml）的试管中，用HaCTL’s液稀释1倍，沿管壁徐徐加入含淋巴细胞分离液试管中（稀释血液与淋巴细胞分离液比例为1∶1）。2 000r/min离心10min。取PMNC层细胞（血浆与分离液之间的白膜）转移至另一无菌试管，加5倍以上体积HaCTL’s液，1 000r/min离心10min，重复3次；加完全培养基悬浮沉淀细胞，37℃静置4h，以去除贴壁细胞。将细胞悬液调整为2×106/ml，备用。
1.2.2 单个核细胞培养基的制备 用1.2.1法分离外周血单个核细胞，以完全1640培养基（10%小牛血清）调细胞浓度为1×106/ml，5% CO2、37℃孵育7d，中间换液一次，收集细胞上清，-70℃冻存备用。
1.2.3 CTL细胞分离 在新鲜制备的单个核细胞悬液中加入鼠抗人CD4单克隆抗体（2×106个单个核细胞中各加入两种单克隆抗体20μl），置4℃作用30min；用HaCTL’s液1 000r/min洗涤10min，重复3次；重悬细胞2×106/ml, 加入适量豚鼠血清（每5ml细胞悬液中加入豚鼠血清0.1ml），37℃作用1h；500r/min离心10min，重复2次，加单个核细胞培养基吹打制备成2×106/ml细胞悬液，备用。
1.2.4 CTL细胞存活率测定 取0.5ml细胞悬液于无菌试管中，加入约0.1ml 0.4%台盼蓝（trypan blue）染液，混合，2min后推片。计数100个细胞，死细胞被染成蓝色，活细胞不着色，根据下式求细胞活力：活细胞率（%）=（细胞总数—死细胞数）/细胞总数×100%
1.2.5 MTT法测定CTL细胞杀瘤活性 传代24h的肿瘤细胞K562作为靶细胞，调细胞浓度至5×107/ml, 加入96孔板，100μl/孔。将不同浓度SEB处理的CTL细胞100μl加入靶细胞孔，效、靶比分别设为5∶1、10∶1、20∶1, 置37℃分别孵育12h、24h、36h和48h；每孔加入MTT(5mg/ml)20μl, 继续孵育5h；取出离心，去上清，每孔加入200μl DMSO，以波长490nm检测各孔吸光度A值，以下式计算杀伤率。杀伤率（%）=[1-（实验组A-效应细胞A）/靶细胞A]×100%
1.2.6 正交设计优化SEB诱导人CTL细胞杀瘤条件 SEB参照国内外文献采用4个浓度组，分别为10-9g/ml、10-8g/ml、10-7g/ml、10-6g/ml；效、靶比分别采用5∶1、10∶1、20∶1；SEB作用时间分别为12h、24h、36h和48h四个水平。本试验中存在三个因素，每个因素又分为不同水平，因此采用L24（42×13）正交表安排的组合进行试验。
2 结果
2.1 CTL细胞存活率 经补体裂解法分离CTL细胞纯度为(86.22±5.12)%，CTL细胞存活率为(87.21±6.02)%。
2.2 正交设计选择CTL细胞最佳杀瘤条件 SEB处理CTL细胞最佳杀瘤条件组合是：SEB浓度10-6g/ml,作用时间24h，效靶比20∶1，见表1。
表1 正交设计选择CTL细胞最佳杀瘤条件结果（略）
3 讨论 CTL细胞可以通过两种机制发挥细胞毒作用：(1)分泌穿孔素、颗粒酶、颗粒溶解素及淋巴毒素等物质直接杀伤靶细胞；(2)通过Fas/FasL途径诱导靶细胞凋亡。CTL在杀伤靶细胞的过程中自身不受伤害，可连续杀伤多个靶细胞。目前T细胞亚群的分离方法比较成熟，包括亲和层析法、percoll密度不连续梯度离心法、补体裂解法、 流式细胞仪法等。 不同方法获得的CTL细胞纯度和活性等方面差异较大。综合考虑分离CTL细胞的纯度和活性，结合实验条件，我们采用补体裂解法分离CTL细胞，获得的CTL细胞纯度为(786.22±5.12)%，CTL细胞存活率为(87.21±6.02)%，基本能满足实验要求。 正常情况下，虽然CTL细胞可以特异杀伤肿瘤细胞，但其杀瘤效率不高。近年来人们考虑应用超抗原作为多克隆活化剂，诱导CTL细胞活化，提高其杀瘤活性。有关这方面的实验研究已有相关报道[3]。超抗原诱导CTL细胞后的杀瘤活性受到多方面因素的影响，但关键因素包括三方面：超抗原浓度、超抗原作用CTL细胞时间和效靶比。每个因素又分为不同水平，采用L24正交表可以用最少的实验次数获得最优的杀瘤条件组合。根据L24正交表，将三个因素的不同水平组合，通过24次实验，经统计学处理，得到了最佳杀瘤条件。试验结果表明：CTL细胞最佳杀瘤条件组合为：SEB浓度10-6g/ml, 作用时间24h，效靶比20∶1。在此条件下，CTL细胞可达最佳杀瘤效率。
【参考文献】 ［1］ Raymond K. Peptide antagonists of superantigen toxins[J]. Molecular diversity, 2004,8(2): 113120.
［2］ 裴银辉，马立人. 超抗原葡萄球菌肠毒素B诱导自然杀伤细胞杀伤肿瘤效应的体外实验研究[J]. 华北煤炭医学院学报，2003,5(4):407409.
