核苷酸切除修复交叉互补基因1在结直肠癌中的表达及其意义

作者：朱娟，肖菊香，张彦兵，王妍华，常浩，吴俊兰，张磊，王乐

作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤内科，陕西 西安 710061

   【摘要】  目的：探讨核苷酸切除修复交错互补基因1(ERCC1)在人结直肠癌中的表达水平，分析其与铂类药物化疗敏感性及生存时间的关系. 方法：以西安交通大学第一附属医院行结直肠癌根治术患者45例和剖腹探查术患者18例的标本为材料，采用免疫组织化学Elivision法检测其ERCC1表达水平. 其中40例复发、转移及晚期患者行草酸铂为基础方案化疗. 所有入组患者随访6年. 结果：肿瘤组织中ERCC1的阳性率为52.08％，低于对照组. 病理分级与ERCC1的阳性率之间有关（P=0.040），病理分级越高，ERCC1阳性率越低，表达强度越弱. ERCC1阴性者铂类药物化疗有效率为60.00%(12/20)，而阳性者则为25.00%(5/20)，二者之间具有统计学差异（P=0.025）；Cox回归分析显示ERCC1表达为结直肠癌患者独立预后因子（P=0.048）. 结论： ERCC1表达可作为预测结直肠癌患者对铂类药物敏感性及预后判断的指标之一.

【关键词】  结直肠肿瘤; 核苷酸切除修复交叉互补基因1; 免疫组织化学; 耐药; 草酸铂

　　Expression of ERCC1 in colorectal cancer and its clinical significance

　　ZHU Juan, XIAO JuXiang, ZHANG YanBing, WANG YanHua, CHANG Hao, WU JunLan,  ZHANG Lei, WANG Le

　　Department of Medical Oncology, First Hospital of Xian Jiaotong University, Xian 710061,  China

　　【Abstract】  AIM: To explore the excision repair crosscomplementing1 (ERCC1) expression level in human colorectal carcinoma, and analyze its relationship with the sensitivity of the platinum drugs and its prognosis. METHODS: Sixtythree archived samples of the patients with colorectal carcinoma were detected by immunohistochemical staining (Elivision). Fortyfive patients underwent radical surgical treatment and 18 patients exploratory laparotomy. All patients were followed up for 6 years after the operation. Forty advanced cases with recurrence and metastasis received oxaliplatinbased chemotherapy. RESULTS: In these 63 patients, the positive expression rate of ERCC1was 52.08％, significantly lower than that in the control group. The positivity rate was correlated with colorectal cancer histologic grade (P=0.040). The histologic grade higher, the positive rate of ERCC1 lower, the expression intensity weaker. In using oxaliplatin cases, the response rate of the ERCC1 negative group was 60.00% (12/20), that of the ERCC1 positive group was 25.00% (5/20). There was significant correlation between the expression of ERCC1 and the efficacy of chemotherapy (P=0.025）. The ERCC1 was an independent prognostic factor of colorectal cancer by the COX regression analysis (P=0.048). CONCLUSION: ERCC1 expression might be one of the prediction markers of the drug sensitivity of the platinum drugs and of prognosis in colorectal cancer.

　　【Keywords】  colorectal neoplasms;  ERCC1;  immunohistochemistry;  resistance; oxaliplatin

　　0引言

　　DNA修复异常与肿瘤发生、肿瘤多药耐药性［1］均有密切联系. 其中核苷酸切除修复系统(nucleotide excision repair, NER)是机体抵抗致癌效应的主要防御机制，也是修复化疗药物所致DNA损伤的主要机制. 核苷酸切除修复交错互补基因1（excision repair crosscomplementing1, ERCC1)是NER的限速酶，起着损伤部位的识别和DNA链5′-3′核酸内切酶的作用，与多种肿瘤发生及铂类药物耐药有关系. 以铂类药物为基础的联合化疗是结直肠癌综合治疗的重要手段之一，耐药是导致患者治疗失败的主要原因. 我们通过检测结直肠癌石蜡包埋组织中ERCC1的表达，分析其与临床生物学特点及铂类药物化疗效果的关系，探讨ERCC1在结直肠癌发生中的意义，并提供一个可逆转耐药的指标.

　1对象和方法

　　1.1对象

　　选取200003/200103在西安交通大学第一附属医院行结直肠癌根治术患者45例和剖腹探察并减瘤术者18例，共63(男36，女27)例，年龄24~75(平均54.56)岁. 部位：结肠27例，直肠36例. TNM分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期20例，Ⅲ期21例，Ⅳ期18例. Ⅱ期及以上期别临床资料完整的患者59例术后均给予化疗. 辅助化疗患者41例均采用含5Fu/CF方案（5Fu 425 mg/m2, iv，第1~5日+CF 200 mg/m2, iv，第1~5日），其中有24例复发转移后进行了含草酸铂的FULFOX4方案治疗(Oxaliplatin 85 mg/m2静脉滴注，2 h，第1日；CF 200 mg/m2，iv，2 h，第1, 2日；5Fu 400 mg/m2推注，然后600 mg/m2持续静脉滴注22 h，第1,2日). 18例晚期患者采用上述FULFOX4方案化疗16例，5Fu/CF方案2例. 疗程3～6周期，平均疗程4.75周期. 对有可测量病灶者采用WHO统一标准进行疗效评价，观察生存期，若末次随访仍然存活则定为截尾值. 随访至200705，随访率为98%，其中死亡42例. 收集同期行肠镜检查病理诊断为正常的结直肠黏膜标本10例，作为正常对照；结直肠癌标本中非癌组织的部分10例，作为癌旁组织对照.

　　1.2方法

　　1.2.1免疫组化检测ERCC1的表达取上述库存蜡块切成5 μm厚切片，常规脱蜡至水，用免疫染色Elivision法，DAB显色进行ERCC1相关抗原的免疫组化染色. 试验中一抗为1∶100稀释的小鼠抗ERCC1单克隆抗体，二抗为即用型第二代免疫组化Elivision TM加光谱试剂盒，均购自福州迈新生物技术开发公司. 以福州迈新生物技术开发公司提供的阳性对照片作为阳性对照；以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照.

　　1.2.2结果判定本实验结果判断标准参照Fromowitz等［2］综合计分法，由阳性着色细胞所占百分数与细胞着色强度二者结合起来计算. 阳性细胞百分数为10个视野阳性细胞的平均数占这10个视野中细胞数的百分比：<5%计0分；5%~25%计1分；26%~50%计2分；51%~75%计3分；>75%计4分. 细胞着色强度：不着色计0分；淡黄色计1分；棕黄色计2分；棕褐色计3分. 二者积分相加：0~1分为阴性，2分为阳性.

　　统计学处理:  用SPSS 13.0统计软件包行ChiSquare检验，KaplanMeier比较生存曲线，并经logrank检验，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1ERCC1的表达ERCC1主要分布于肿瘤细胞胞核中，色黄，分布均匀，颗粒细(图1)；某些细胞质中也有表达（图2），集中于核膜周围. 人结直肠癌组织中ERCC1阳性率为52.38%；癌旁组织中阳性率为80.00%；正常结直肠粘膜组织中阳性率为90.00%. 经统计学分析，癌组织与癌旁组织、正常组织中ERCC1的阳性率有差异（P值分别为0.017, 0.014）；正常组织与癌旁组织无显著性差异（P=0.523）. 癌组织中ERCC1低水平表达.

　　2.2ERCC1与结直肠癌患者生物学特点的关系

　　63例结直肠癌标本中，病理学分级为Ⅰ级者11例，阳性率81.81％；Ⅱ级者34例，阳性率52.94％；Ⅲ级者18例，阳性率33.33％. 经统计学分析，病理分级与ERCC1表达之间有关（P=0.040）. 病理分级越高，ERCC1阳性率越低，表达强度越弱. ERCC1表达与性别、年龄、部位、分期无关（表1）.表1ERCC1表达与结直肠癌生物学特点的关系（）

　　2.3ERCC1的表达与化疗疗效之间的关系

　　59例化疗患者中可评价疗效者42例. 其中草酸铂组40例，总有效率为42.50％（17/40）；ERCC1阴性者化疗有效率为60.00%(12/20)，阳性者有效率为25.00%(5/20). 二者之间具有统计学差异（χ2=5.013，P=0.025），ERCC1阴性者化疗有效率高于阳性者.

　　2.4ERCC1表达水平与预后的关系

　　ERCC1表达阳性与阴性患者的生存曲线分析显示ERCC1阴性患者5 a生存率为53.33%, ERCC1阳性患者为27.27%，具有统计学差异(χ2=4.459，P=0.035). Cox回归分析显示ERCC1表达（P=0.048）为结直肠癌患者独立的预后因子（图3）.

　3讨论

　　NER系统是DNA最主要的修复机制，其功能异常在多种肿瘤的发生、发展过程中起重要作用［3］. ERCC1在NER系统中起着损伤识别和核酸内切酶的双重功能，其表达水平可以代表NER系统的活性. ERCC1基因是利用对紫外线敏感的中国仓鼠细胞（CHO）和人类瘤细胞株进行细胞融合和互补试验而克隆出的一种与紫外线敏感的突变型鼠细胞互补的人类修复基因，定位于染色体19q13.2，共有四种分子量的mRNA，但只有111 kb的mRNA表达出Mr为33 000~36 000的蛋白时，才表现其功能. 根据Ted等［4］的文献报道，ERCC1基因属于肿瘤抑制基因中的看家（caretakers）基因的一种.

　　文献报道在卵巢癌的研究中发现恶性程度更高的透明细胞癌中ERCC1表达比其他病理类型表达更加低下，说明了ERCC1的表达与细胞分化程度有关系，分化程度越差，修复功能越低下［5］. Saeb等［6］对156例结肠癌患者组织和399例正常者进行对照后发现，二者之间ERCC1的表达存在差异（P=0.011）. Kwon等［7］通过免疫组化法检测64例进展期胃癌患者组织中ERCC1, TS和GSTP1的表达，发现ERCC1阳性对FULFOX方案化疗的敏感性显著低于阴性患者（P=0.045）. 逯晓波等［8］通过构建包含ERCC1基因的表达载体,转染UV20细胞后，通过细胞抑制率测定(SRB)评价草酸铂的细胞毒作用，发现获得转染成功的UV20ERCC1细胞,ERCC1表达水平增加与草酸铂敏感性降低密切相关. Azuma等［9］通过免疫组化法检测67例肺癌患者组织中ERCC1,P53及TRK的表达，发现ERCCI阴性患者中位无进展时间和总生存时间均高于阳性患者. 本研究结果与文献报道结果一致，说明在结直肠癌中，ERCC1表达可作为预测草酸铂化疗敏感性的指标之一. 其主要机制可能为铂类药物作用后，受损细胞周期阻滞在G2/M期，而ERCC1过表达可使停滞在G2/M期损伤的DNA迅速修复，受损肿瘤细胞存活增多.

　　近年来,通过反义RNA干扰ERCC1 mRNA的表达以及其他用分子生物学手段作用于ERCC1可以逆转铂类药物耐药. Selvakumaran等［10］通过反义RNA方法作用于对顺铂敏感的A2780细胞系和顺铂高度耐药的OVCAR10细胞系的ERCC1基因，使得耐药株的IC50值明显下降. 刘国艳等［11］通过RNA干扰技术抑制卵巢上皮性癌ERCC1，发现能增加卵巢癌细胞ES2对顺铂的敏感性. 今后有望通过干扰ERCC1的表达来提高铂类药物化疗疗效.

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　　［3］Bartels CL，Lambert MW. Domains in the XPA protein important in its role as a processivity factor ［J］. BBRC，2007，356(1)：219- 225.

　　［4］Ted BT，Larsson C，Nordenskjold M，et al. Tumor suppressor genes(TSG) ［J］. Anticancer Res，1999，19(6A)：4715-4728.

　　［5］Reed E，Yu JJ，Davies A，et al. Clear cell tumors have higher mRNA levels of ERCC1 and XPB than other histological types of epithelial ovarian cancer ［J］. Clin Cancer Res，2003，9(14)：5299-305.

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　　［11］刘国艳，瞿全新，糜若然，等. RNA干扰技术抑制切除修复交叉互补基因1对卵巢上皮性癌细胞顺铂敏感性的影响［J］. 中华妇产科杂志，2006，41（5）：339-342.