IL18基因转导乳腺癌细胞肿瘤原性的改变及抗瘤作用的研究
发表时间:2009-11-13 浏览次数:415次
IL18基因转导乳腺癌细胞肿瘤原性的改变及抗瘤作用的研究作者:韩明勇 作者单位:山东大学山东省立医院肿瘤中心, 山东 济南 250021 【摘要】 建立转人白细胞介素18(IL18)基因的乳腺癌细胞株Bcap37细胞,并探讨IL18基因转导后Bcap37细胞肿瘤原性的改变和抗瘤作用。方法:将携带人IL18的质粒pcDNA3.1IL18转导入人乳腺癌细胞系Bcap37细胞中,通过药物G418进行筛选,采用RTPCR和ELISA法对IL18基因的表达进行检测;裸鼠致瘤实验观察肿瘤原性的改变;观察灭活后Bcap37IL18细胞的抗瘤作用。结果:IL18基因成功转导入Bcap37细胞中并能顺利表达;RTPCR 电泳结果显示IL18基因在mRNA水平有表达;ELISA结果显示,106个转导细胞在24?h内分泌IL18的含量是(126.3±4.5)pg; 空载体转染的细胞未检测到IL18;裸鼠致瘤实验表明,接种Bcap37IL18细胞的裸鼠肿瘤的生长速度明显低于Bcap37组和Bcap37pCDNA3.1组;抗瘤实验结果显示,放射灭活的Bcap37pcDNA3.1细胞和Bcap37IL18细胞免疫接种裸鼠后,再接种Bcap37细胞于裸鼠左侧背部皮下。肿瘤长出的时间Bcap37IL18细胞免疫接种组比Bcap37pCDNA3.1细胞免疫接种组明显延长,且肿瘤的体积Bcap37IL18细胞免疫接种组比Bcap37pCDNA3.1细胞免疫接种组小。结论: IL18基因能成功的整合到Bcap37细胞基因组中,且在转导的肿瘤细胞中持续表达;IL18基因转染降低了Bcap37细胞的肿瘤原性;IL18基因修饰的Bcap37细胞具有明显的抗肿瘤作用。 【关键词】 白细胞介素18 乳腺肿瘤 肿瘤细胞 转染 肿瘤原性 HAN Mingyong1, LIU Qi1, TANG Bujian2, DENG Yan2, CAO Mingfeng1(1. Department of Tumor Treatment Center, Shandong Provincial Hospital, Jinan 250021,Shandong, China; 2 Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi, China) [ABSTRACT] Objective: To study the effect of the interleukin18 gene transfection on tumorigenesis of the human breast carcinoma cell line Bcap37. Methods: Bcap37 cells were transfected with a mammalin expression vector containing human IL18 complementary DNA. The biological expression of IL18 was determined by the RTPCR and ELISA methods. Nude mice were injected with Bcap37 cells with or without the IL18 gene. Results: The IL18 cDNA was successfully integrated into the Bcap37 cells. There were (113.8±4.7)pg IL18 secreted by one million transduced cells in 24 hours. In vivo tumor growth curves, based on measured tumor size, Bcap37, Bcap37pcDNA3.1 and Bcap37IL18 resulted in tumor formation from 8 to 11 days after injection. The growth rate of Bcap37IL18 in vivo was significantly slower than that of Bcap37 and Bcap37pcDNA3.1 cells. Tumor formation by parental Bcap37 cells was significantly delayed in mice that had been immunized with Bcap37IL18 irradiated cells. Conclusion: Human breast carcinoma cells were successfully modified by IL18 cytokine genes and reduced the tumorigenicity. Breast cells transduced with IL18 genes might be used as human colon cancer vaccines. [KEY WORDS] Interleukin18; Breast neoplasms; Transfection; Tumor cells, cultured; Vaccine 白细胞介素18(IL18)又名IFNλ诱导因子(IGIF), 是近年新发现的一种细胞因子,主要由激活的单核细胞和巨噬细胞产生。研究表明[1,2],IL18能诱导T细胞和NK细胞产生IFNλ,是参与启动细胞免疫反应的重要细胞因子,具有显著的抗肿瘤效应。将细胞因子基因如IL2,转移到肿瘤细胞制成的肿瘤瘤苗,能够诱导机体内抗肿瘤免疫功能。本研究将IL18基因转入人乳腺癌细胞系Bcap37细胞中,观察IL18基因转染后Bcap37细胞分泌IL18的水平,以及IL18基因转染后Bcap37细胞致瘤性的改变及其抗瘤作用,为制备乳腺癌基因工程肿瘤疫苗提供实验基础。1 材料与方法 1.1 主要试剂和质粒 Lipofectamine2000购自德国QIAGEN公司,筛选药物GENETICIN(G418 Sulfte),限制性内切酶Bamh Ⅰ和Xho Ⅰ均购自Gibco公司,DMEM 培养基购自美国Hyloe公司,其它试剂均用国产分析纯。IL18质粒DNA(pcDNA3.1hIL18)由浙江大学肿瘤研究所构建。 1.2 菌株和细胞株 EColi 感受态细菌由浙江大学肿瘤研究所传代保存;人乳腺癌细胞系Bcap37细胞购自中科院上海细胞所。 1.3基因转染 取对数生长期的Bcap37细胞,0.25%胰酶消化,计数,分别接种于六孔板中,每孔1.5×105个细胞。置培养箱中培养24?h后,用脂质体介导法进行基因转染,同时设空载体及不转染细胞做对照。以600?μg/ml的G418进行筛选,获得G418抗性克隆。待细胞长至70%融合时,将细胞传入多个培养瓶中扩大培养,培养基中筛选药物G418的浓度降至300?μg/ml。 1.4 RTPCR提取细胞RNA 引物上游:5′ggatccatgtgtcaccagcagttg,下游:5′gcctcgagctagtcttcgttttgaaca。 1.5 ELISA 法测定转导细胞中IL18 收集24?h培养细胞上清液,采用ELISA法测定上清液中人IL18含量。此法敏感度为5?pg/ml上清液。 1.6 裸鼠致瘤实验 将处于对数生长期的Bcap37、Bcap37pcDNA3.1及Bcap37IL18细胞洗两遍,0.25%胰酶消化,悬浮于生理盐水中,调整细胞浓度达1×107个/ml, 取0.1?ml接种于裸鼠背部皮下。所有裸鼠按照SPF级要求条件下喂养。仔细观察裸鼠生存情况和肿瘤的生长。每4?d用游标卡尺测量1次肿瘤大小(最大径+垂直径/2)。 1.7 Bcap37IL18细胞的抗瘤实验 将Bcap37pcDNA3.1细胞和Bcap37IL18细胞应用放射线灭活(100?Gy),调整细胞浓度为1×107个/ml, 取0.1?ml接种于裸鼠左侧背部皮下,每周1次,连续3次。于次日将1×106个/ml的Bcap37细胞接种于裸鼠右侧背部皮下。仔细观察裸鼠生存情况和肿瘤的生长。每4?d用游标卡尺测量1次肿瘤大小(最大径+垂直径/2)。 1.8 统计学处理 所有数据均采用随机区组设计资料的方差分析,采用SPSS统计学软件处理。2 结 果 2.1 转染细胞的生长情况 转染48?h后,将细胞传入培养瓶中,细胞贴壁、生长状况良好。24?h后开始加入筛选药物G418,11?d时未转染组细胞全部死亡,转染组仍有细胞存活,15?d后转染组细胞克隆形成,细胞生长良好,说明这些细胞具有G418抗性,即Bcap37细胞中已转入目的质粒。 2.2 IL18 基因在转导细胞中的表达 RTPCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示,转入pCDNA3.1(+)IL18 的Bcap37细胞克隆在570?bp部位出现产物带;转入pCDNA3.1(+) 空载体的Bcap37细胞克隆和未转导的Bcap37细胞克隆没有出现产物带。表明IL18基因已成功的转入Bcap37细胞中,并且在mRNA水平已有表达(见图1)。 2.3 ELISA法测定IL18含量结果 见表1。由表1可见,106个转染细胞在24?h内分泌IL18的含量平均是(126.3±4.5)pg;空载体转染的Bcap37细胞和未转染的Bcap37细胞上清液中未检测到IL18。表明转染IL18基因的Bcap37细胞能分泌IL18(见表1)。 2.4 裸鼠致瘤实验 转染空载体的Bcap37细胞和未转染的Bcap37细胞接种的5只裸鼠都长出肿瘤,而接种转Bcap37IL18细胞的5只裸鼠中只有2只有肿瘤长出;体内肿瘤生长的曲线表明,接种Bcap37、Bcap37 pCDNA3.1及Bcap37IL18细胞后,裸鼠在第8 11?d长出肿瘤。且Bcap37IL18组肿瘤的生长速度明显低于Bcap37组和Bcap37 pCDNA3.1组。 2.5 Bcap37IL18细胞的抗瘤实验 应用放射线灭活的 Bcap37pcDNA3.1细胞和Bcap37IL18细胞免疫接种裸鼠后,再接种Bcap37细胞于裸鼠右侧背部皮下。肿瘤长出的时间Bcap37IL18细胞免疫接种组比Bcap37pcDNA3.1细胞免疫接种组明显的延长,且肿瘤的体积Bcap37IL18细胞免疫接种组比Bcap37细胞免疫接种组明显的小,见图2。3 讨 论 转基因肿瘤细胞株的建立和生物学活性研究是肿瘤基因治疗的重要基础。研究表明[3,4],将编码细胞因子的基因导入肿瘤细胞构建肿瘤疫苗,经过处理后使其失去致癌性,而保存分泌细胞因子的能力,通过细胞因子的生物学活性,诱导细胞毒性细胞(CTL)、NK细胞的活性,能显著增强机体抗肿瘤免疫。研究表明[5]用IL2基因转染肾癌细胞(SKRC29)制备瘤苗,经γ射线50?Gy照射后,肿瘤细胞生长停止,该转染细胞失去致瘤性后,仍能分泌IL2因子, 将该细胞灭活后注入荷瘤鼠腹腔内,具有明显的抗肿瘤作用。研究表明[6],转染鼠IL18基因的肿瘤细胞株在同基因鼠体内的致瘤性下降,肿瘤生长速度减慢,动物存活期明显延长。但也有研究发现[7]ASPC1细胞转染鼠IL18基因后未产生任何抗瘤作用,转染细胞的肿瘤生长速度与野生型细胞相同。研究表明[8],将构建好的IL18重组腺病毒质粒气道内应用,可诱导较高水平的NK活性,对实验性和自发性肺转移癌有良好的治疗作用,提示IL18可用于肿瘤基因治疗。 本研究中采用Lipofectamine2?000 将携带人IL18基因的质粒pCDNA3.1hIL18转导入Bcap37细胞中,并筛选出阳性克隆。RTPCR结果表明,转入的人IL18基因在Bcap37细胞中能稳定表达。ELISA 法测定结果显示,106个转染细胞在24小时内分泌IL18的含量是(126.3±4.5)pg。空载体转染的Bcap37细胞和未转染的Bcap37细胞上清液中未检测到IL18。表明IL18基因转染的Bcap37细胞能分泌hIL18因子。裸鼠致瘤实验表明,接种Bcap37IL18细胞的裸鼠肿瘤的生长速度明显的低于接种Bcap37细胞组和Bcap37pCDNA3.1细胞组;Bcap37IL18细胞的抗瘤实验结果显示,放射线灭活的Bcap37pCDNA3.1细胞和Bcap37IL18细胞免疫接种裸鼠后,再接种Bcap37细胞于裸鼠右侧背部皮下。肿瘤长出的时间Bcap37IL18细胞免疫接种组比Bcap37细胞免疫接种组明显延长,且肿瘤的体积Bcap37IL18细胞免疫接种组比Bcap37细胞免疫接种组小。本研究结果表明,人IL18基因能成功的整合到Bcap37细胞基因组中,且能在转导的Bcap37细胞中持续表达. IL18基因转染降低了Bcap37细胞的肿瘤原性;IL18基因修饰的Bcap37细胞具有明显的抗肿瘤作用,为乳腺癌基因工程肿瘤疫苗的研制提供了实验基础。【参考文献】 [1] Okamoto I, Kohno K, Tanimoto T, et al. Development of CD8+ effector T cells is differentially regulated by IL18 and IL12[J]. J Immunol, 1999, 162(34):3?2023?211. [2] Chaudhry UI, Kingham TP, Plitas G, et al. Combined stimulation with interleukin18 and CpG induces murine natural killer dendritic cells to produce IFNgamma and inhibit tumor growth[J]. Cancer Res, 2006, 66(21):10?49710?504. [3] Kim KE, Song H, Kim TS, et al. Interleukin18 is a critical factor for vascular endothelial growth factorenhanced migration in human gastric cancer cell lines[J]. Oncogene, 2007, 26(10):1?4681?476. [4] Hashimoto W, Oksaki T, Okamura H, et al. Differential antitumor effects of administration of rIL18 or RIL12 are mediated primarily by FasFas Ligand and perforininduced tumor apoptosis, respectively[J]. J Immunol, 1999, 163(25):583589. [5] Robertson MJ, Mier JW, Logan T, et al. 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