食管癌组织芯片COX22和survivin表达及其与预后的关系

食管癌组织芯片COX²2和survivin表达及其与预后的关系作者：田锋，王天佑，常栋，龚民，佟玉筠    作者单位：100050 北京，首都医科大学附属北京友谊医院胸外科   【摘要】  目的 研究食管癌组织中COX²2和survivin蛋白的表达，及其预后意义。方法 采用免疫组化EnVision法和组织芯片技术，检测手术切除的56例食管癌组织中COX²2和survivin蛋白的表达状况，通过Cox比例风险模型进行多因素分析，探讨与食管癌患者预后的关系。结果 COX²2和survivin在食管癌组织阳性表达率分别为69.6％和71.4％。COX²2和survivin表达呈正相关（r=0.614，P=0.002），且与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关。COX²2表达阳性患者的中位生存时间明显短于阴性患者（25.13月 vs.69.33月，P=0.0001），survivin表达阳性患者的中位生存时间明显短于阴性患者（25.23月vs. 69.32月，P=0.0000）。Cox多因素分析表明，COX²2和survivin蛋白阳性表达为影响食管癌患者预后的独立因素。结论 COX²2和survivin在食管癌中呈过度表达，且呈正相关，二者在肿瘤中可能发挥协调作用。COX²2和survivin高表达预示食管癌的不良预后，可以作为影响食管癌患者预后的独立因素。    【关键词】  食管癌/鳞状细胞癌 COX²2 survivin 组织芯片 预后0  引言    食管癌在我国是常见恶性肿瘤之一，尽管近年来对食管癌的研究取得较大进展，其发病率和死亡率有所下降，但仍位居肿瘤发病率的第四位，死亡率的第二位[1]。术后5年生存率仅20％～25％左右[2]。最近研究表明，COX²2和survivin在多种肿瘤组织中高表达，提示它们参与了肿瘤的发生、发展，并促进了恶性肿瘤的侵袭转移。但目前有关COX²2和survivin在肿瘤中相互作用机制所知甚少，二者在食管癌组织中表达状况与预后关系的研究报道也少见。本研究采用组织芯片技术，应用免疫组织化学方法检测食管癌术后的肿瘤组织中COX²2和survivin蛋白的表达情况，探讨COX²2和survivin表达的相关性、与患者临床病理特征以及与预后的关系。1  资料和方法　　1.1  临床资料    56例食管鳞癌石蜡标本均来源于2000年1月～2001年12月北京友谊医院病理资源库。56例食管癌患者中，男37例，女19例，年龄31～77岁，中位年龄63.5岁。食管癌部位：中段35例，下段21例；分化程度：高分化29例，中分化22例，低分化5例； TNM分期按1997年国际抗癌联盟（UICC）制定标准进行分期：I期1例，IIa期29例，IIb期8例，Ⅲ期18例。所有病例术前均未进行化疗及放疗。采用电话或信函方式对56例患者进行了随访，失访3例。生存时间按月计算，以手术日至末次随访所得的截尾时间为准。随访截止日期2007年2月28日，在此期间死于食管癌相关疾病者为完全数据，生存和失访病例按截尾数据处理。　　1.2  组织芯片的制备    由病理专家对每一组织标本，观察HE切片，选取目标肿瘤组织并在HE切片及相应组织蜡块上标记。用组织芯片制作机（Beecher Instruments,USA）在受体蜡块上打孔，孔径2.0mm，深度3～4mm。在供体蜡块的标记部位打洞采集组织芯，其长度比打孔的深度短0.1mm，将组织芯推入受体蜡块孔内。为易于分辨组织芯片上各组的序号，第一个组织芯以正常肝组织作为标志。如此反复，共制成8×4和7×4两个组织芯方阵。组织芯片蜡块修片后连续切片，厚度4μm。用经2%APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，用于HE染色（重新评估肿瘤的病理特征）和免疫组织化学染色。　　1.3  免疫组织化学染色    免疫组化采用En²Vision二步染色法，4μm厚的组织芯片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3%H2O2 阻断内源性过氧化物，TBS 3min, EGTA(pH9.0)微波修复15min复凉至室温, TBS 3min, 第一抗体（COX²2： 兔抗人多克隆抗体ZA²0515；survivin：兔抗人多克隆抗体ZA²0458）60min, En²Vision（PV²6001）30min, TBS 3min, DAB 2～10min, 自来水冲洗, 苏木素复染, 自来水冲洗, 梯度乙醇脱水，水性封片胶封固。　　1.4  免疫染色的评估    免疫组织化学染色后的组织芯片切片均经三位观察者重复且独立的进行评估。评估者对其组织切片的背景信息并不了解，以其中两位的评分为某组织点的得分。以预实验食管癌COX²2和survivin的染色阳性作阳性对照，TBS代替一抗作阴性对照，以癌旁正常组织作内对照。COX²2和survivin染色强度分为0～3四级（0级：阴性；1级：弱阳性；2级：中等强度阳性；3级：强阳性）。根据组织切片中阳性染色区域占肿瘤组织区域的比例，染色的范围标记为0（0）、1（1%～25%）、2（26%～50%）、3（51%～75%）、4（76%～100%）。两个等级评分之和作为最后的染色积分，其积分≥2被认为该组织切片免疫组织化学染色阳性[3]。　　1.5  统计学方法    采用SPSS12.0统计软件对实验结果进行分析，各组间率的比较采用χ2检验、Fisher’s精确概率法检验。COX²2和survivin之间采用Spearman秩相关分析。生存分析采用Kaplan²Meier曲线分析，并进行Log Rank检验。Cox比例风险模型进行多因素分析。显著性取α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。2  结果　　2.1 COX²2和survivin在食管癌组织中表达    食管癌组织免疫组织化学染色，细胞中COX²2和survivin蛋白的阳性反应物质呈黄色或棕黄色，COX²2主要分布于细胞质和细胞膜。而survivin则分布于细胞核。COX²2和survivin在癌旁正常组织中无明显表达，在肿瘤间质中的吞噬细胞偶有表达。COX²2和survivin在食管癌组织阳性表达率分别为69.6%（39例/56例）和71.4%(40例/56例)。　　2.2  食管癌组织中COX²2和survivin蛋白表达与临床病理特征关系    COX²2表达与性别（P=0.543）、年龄（P=0.561）和分化程度（P=0.216）无关。与肿瘤浸润深度(P=0.046)、淋巴结转移(P=0.001)及TNM分期(P=0.001)密切相关。survivin表达与性别（P=1.000）、年龄（P=1.000）和分化程度（P=0.333）差异无统计学意义，与肿瘤浸润深度(P=0.020)、淋巴结转移(P=0.003)及TNM分期(P=0.002)具有相关性。  　2.3  COX²2与survivin表达的相关性    56例组织中COX²2和survivin共阳性表达35例（62.5%），两者表达呈正相关（P=0.000，r=0.614），见表1。　　2.4  COX²2与survivin表达与患者预后关系    COX²2表达阳性患者的5年累计生存率为15.38%，中位生存时间为25.13月，阴性患者5年累计生存率为64.17%，中位生存时间69.33月，（Log rank检验，χ2=15.97，P=0.0001）,见图1。survivin表达阳性患者与阴性患者相比，中位生存时间显著缩短，分别为25.23月和69.32月（Log rank检验，χ2=22.80，P=0.0000）。5年累计生存率分别为75.00%和12.50%，见图2。　　表1  COX²2与survivin蛋白表达的关系（略）　　Tab 1  Relationship between COX²2 and　survivin protein expression in ESCC　　　图1  食管癌患者COX²2表达的Kaplan²Meier生存曲线（略）　　Fig 1  Kaplan²Meier survival curves for COX²2　expression in patients with esophageal carcinoma　　图2  食管癌患者survivin表达的Kaplan²Meier生存曲线（略）　　Fig 2  Kaplan²Meier survival curves for survivin　expression in patients with esophageal carcinoma    进一步将T分期，N分期，TNM分期，肿瘤分化程度，COX²2和survivin蛋白表达6个因素强制引入Cox比例风险模型，进行多因素分析，回归模型的χ2=30.078，P=0.000，模型具有意义。截止到随访死亡47例，存活9例，存活率16.1%。肿瘤分化程度、TNM分期、COX²2、survivin各因素回归系数为正值，表明其与术后死亡率正相关。其中COX²2和survivin差异有统计学意义（P=0.037，P=0.001），发现COX²2和survivin是影响预后的独立因素，见表2。3  讨论    影响食管癌的预后有多种因素，COX²2的高表达是否为影响因素之一，目前尚无定论。Liu等[4]研究结果表明COX²2的高表达与患者的预后相关。本研究结果显示：COX²2阳性表达患者的术后中位生存期明显低于阴性表达组，通过Cox比例风险模型分析，COX²2阳性表达患者术后风险增加2.588倍，COX²2表达是独立的预后影响因素。但Shamma等[5]分析了45例食管鳞癌患者术后的生存情况，认为COX²2低表达组与高表达组的总体生存率无显著差别。    Kato等[6]研究发现在经治疗获得部分缓解的食管鳞癌患者中survivin表达率显著低于无变化或进展期患者，其高表达患者中位生存时间9月，而低表达的患者为30月。Mega等[7]对122例切除食管鳞癌的组织标本检测发现，细胞核表达阳性68例（56%），与淋巴结转移（P=0.047）和总生存时间（P=0.019）明显相关。而Rosato等[8]对比检测了56例食管鳞癌和56例食管腺癌survivin mRNA及蛋白的表达，患者高水平表达的总生存时间较低表达显著缩短（P=0.0033），单变量分析survivin mRNA与预后相关（P=0.0012）。多因素Cox风险模型分析表明，survivin是食管鳞癌患者重要预后因子。我们的研究结果与上述类似，研究表明，survivin的高表达与食管癌的发生、发展有关，是预测食管癌预后的重要指标。    表2  食管癌患者预后的Cox模型多因素分析（略）　　Tab 2  Multivariate analysis by Cox regression model on the prognosis of ESCC patients　　体外和动物实验研究表明，COX²2与survivin在抑制肿瘤细胞凋亡过程中发挥共同促进作用。COX²2主要通过增强survivin的表达而起到抑制肿瘤细胞凋亡的作用[9²10] 。Wu等[11]通过体外研究发现，COX²2抑制剂塞来考昔能够激活caspase²3、caspase²9途径，诱导肝脏胆管细胞癌的凋亡。新近研究[12]指出，在NSCLC中COX²2过表达和PGE2的增加抑制了survivin的泛素化，阻止survivin的蛋白酶体降解，增强了survivin的稳定表达。我们实验结果COX²2和survivin在食管癌中表达呈正相关，从临床上间接证实了以上的观点。    有关COX²2与survivin联合检测在临床方面的研究报道不多，Barnes等[13]对161例乳腺原位导管癌患者采用免疫组织化学方法检测了COX²2和survivin蛋白的表达状况，并与术后复发因素相比较，发现两者的表达呈正相关；COX²2和survivin同时阳性表达与单一各自阳性表达的患者，其术后5年复发率显著增加，认为COX²2和survivin双表达是乳腺原位导管癌患者术后复发的危险因素。张惠忠等[14]应用免疫组织化学方法对77例NSCLC患者术后标本进行了COX²2和survivin联合检测发现，survivin蛋白的表达与NSCLC的血管密度、淋巴结转移、临床复发呈正相关，与患者术后生存期呈负相关，COX²2蛋白的表达与血管密度呈正相关，与患者术后生存时间呈负相关。以往研究已肯定疾病的分期对食管癌预后的影响最大，而本实验显示COX²2与survivin的表达与食管癌的肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期的临床转归同样具有显著相关性，但把以上指标引入Cox比例风险模型分析，只发现COX²2和survivin蛋白阳性表达为影响食管癌患者预后的独立因素，而肿瘤分化程度和TNM分期虽然会增加食管癌术后的风险，但差异无统计学意义。可能原因是由于本组样本数量有限，统计学出现偏倚所致，有待今后进一步加以研究。    从目前的研究结果可以发现，在肿瘤组织内COX²2和survivin蛋白的表达具有相关性，两者在肿瘤中可能发挥协调作用。COX²2选择性抑制剂在体外和动物模型中可以抑制肿瘤的生长，增加肿瘤组织对放化疗的敏感性，目前已有许多实验小组正在进行将塞来昔布与放疗、放化疗相结合用于肿瘤的临床研究。针对survivin的靶向治疗与其他促凋亡治疗（如COX²2抑制剂等）相结合，弥补相互治疗上的不足，临床上对COX²2与survivin的检测将有利于选择更合适的治疗，并准确地判断患者的预后。【参考文献】 　［1］ 张思维，陈万青，孔灵芝，等. 中国部分市县1998²2002年恶性肿瘤的发病与死亡[J].中国肿瘤, 2006, 15(7):430²438.　　[2] 李泽坚.我国胸外科的发展和展望[J].中华外科杂志，2006, 44(14)937²939. 　　[3] Smith WL, Langenbach R. Why there are two cyclooxygenase isozymes[J]. J Clin Invest, 2001,107(12):1491²1495.　　[4] Liu JF, Jamieson G, Wu TC, et al. Cyclooxygenase²2 expression in squamous cell carcinoma of the esophagus[J]. Dis Esophagus, 2006,19(5):350²354.　　[5] Shamma A, Yamamoto H, Doki Y, et al. Up²regulation of cyclooxygenase²2 in squamous carcinogenesis of the esophagus[J]. Clin Cancer Res, 2000,6(4):1229²1238.　　[6] Kato J, Kuwabara Y, Mitani M, et al. Expression of survivin in esophageal cancer: correlation with the prognosis and response to chemotherapy[J]. Int J Cancer, 2001,95(2):92²95.　　[7] Mega S, Miyamoto M, Li L, et al. Immunohistochemical analysis of nuclear survivin expression in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Dis Esophagus, 2006,19(5):355²359.　　[8] Rosato A, Pivetta M, Parenti A, et al. Survivin in esophageal cancer: An accurate prognostic marker for squamous cell carcinoma but not adenocarcinoma[J]. Int J Cancer, 2006,119(7):1717²1722.　　[9] Krysan K, Dalwadi H, Sharma S, et al. Cyclooxygenase 2²dependent expression of survivin is critical for apoptosis resistance in non²small cell lung cancer[J]. Cancer Res, 2004,64(18):6359²6362.　　[10] Dalwadi H, Krysan K, Heuze²Vourc'h N, et al. Cyclooxygenase²2²dependent activation of signal transducer and activator of transcription 3 by interleukin²6 in non²small cell lung cancer[J]. Clin Cancer Res, 2005,11(21):7674²7682.　　[11] Wu T, Leng J, Han C, et al. The cyclooxygenase²2 inhibitor celecoxib blocks phosphorylation of Akt and induces apoptosis in human cholangiocarcinoma cells[J]. Mol Cancer Ther, 2004,3(3):299²307.　　[12] Krysan K, Merchant FH, Zhu L, et al. COX²2²dependent stabilization of survivin in non²small cell lung cancer[J]. FASEB J, 2004,18(1):206²208.　　[13] Barnes N, Haywood P, Flint P, et al. Survivin expression in in situ and invasive breast cancer relates to COX²2 expression and DCIS recurrence[J]. Br J Cancer, 2006,94(2):253²258.　　[14] 张惠忠，魏益平，华平，等. Survivin蛋白在非小细胞肺癌组织表达及与COX²2蛋白的关系[J].中国热带医学, 2006,6(10):1775²1777.