小檗胺诱导人白血病Jurkat细胞凋亡的实验研究

小檗胺诱导人白血病Jurkat细胞凋亡的实验研究作者：黄志煜，董庆华    作者单位：浙江省肿瘤医院，浙江 杭州 310022    【摘要】  ［目的］ 研究小檗胺诱导人白血病Jurkat细胞凋亡的机制。［方法］ MTT法测人白血病Jurkat细胞IC50值及细胞毒作用，Hoechst33258荧光染色法观察小檗胺凋亡小体形成，流式细胞仪Annexin-Ⅴ FITC-PI法检测细胞凋亡发生率，PI染色法检测凋亡峰及细胞周期，同时流式细胞仪检测细胞caspase-3蛋白表达。 ［结果］ 小檗胺能选择性抑制人白血病Jurkat细胞生长且呈浓度依赖关系，作用48h Jurkat细胞IC50值为6.6±0.5μg/ml；小檗胺能诱导Jurkat细胞凋亡，使细胞周期阻滞于S期；同时细胞caspase-3蛋白表达增高。 ［结论］ 小檗胺能激活caspase-3蛋白表达，诱导人白血病Jurkat细胞凋亡且呈时效关系。    【关键词】  Jurkat细胞    Experimental Study of Berbamine Inducing Apoptosis in Human Leukemia Jurkat Cells HUANG Zhi-yu1, DONG Qing-hua2 (1.Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou 310022, China;2.Cancer Institute of Zhejiang University, Hangzhou 310009, China)    Abstract: ［Purpose］ To explore the mechanism of berbamine inducing apoptosis in human leukemia Jurkat cells. ［Methods］ IC50 value and cytotoxity of human Jurkat cells were detected by MTT method; apoptotic body, by fluorescent staining with Hoechst33258; cell apoptotic rate, by FCM with Annexin-Ⅴ FITC-PI staining method; apoptotic peak, cell cycle and protein expression of caspase-3, by FCM. ［Results］ Berbamine could significantly inhibit the proliferation of Jurkat cells in a dose-dependent manner and the IC50 value was 6.6±0.5μg/ml at 48 hours. Berbamine also selectively induced apoptosis of Jurkat cells which were arrested in the S phase. In addition, expression of caspase-3 protein of Jurkat cells increased after exposure to berbamine. ［Conclusions］ Berbamine can selectively induce apoptosis of human leukemia Jurkat cells in the manner of dose and time dependence through up-regulation expression level of caspase-3 protein.    Key words: berbamine; Jurkat cells; apoptosis; caspase-3    小檗胺是一种双苄基异喹啉生物碱类化合物，具有抗氧化、免疫抑制、升高白细胞等多种临床作用[1]。最近的研究表明，小檗胺能调节细胞内游离钙浓度[2,3]，下调多药耐药基因表达以逆转多药耐药[4]，有少量研究显示其对肿瘤细胞的增殖抑制作用[5,6]，但其作用机制仍不甚清楚。本实验观察小檗胺对人白血病Jurkat细胞凋亡诱导作用，并对其作用机制进行探讨。1   材料与方法    1．1   药品与试剂     MTT、碘化丙啶（PI）、小檗胺、Hoechst33258为Sigma公司产品，RPMI 1640培养基为美国Hyclone公司产品，Annexin-Ⅴ FITC-PI试剂为Immunotech公司产品，Cytofix/Cytoperm、Caspase3-PE及鼠IgG1-FITC/PE同型阴性对照为美国Pharmingen公司产品。    1．2   实验材料和主要仪器      细胞培养瓶及培养板为丹麦Nunclon公司产品；超净工作台及CO2培养箱为德国Heraeus产品；Wallac酶标仪为芬兰产品；FACSCan流式细胞仪为美国BD公司产品；Axioskop 2荧光显微镜为Zeiss公司产品。    1．3   细胞系及培养     Jurkat细胞购自上海细胞生物所，10%小牛血清，5%CO2，37℃孵箱中常规培养。    1．4   MTT法测Jurkat细胞的IC50值及生长抑制曲线    取对数生长期细胞接种于96孔培养板内，6复孔。每孔３×104个/ ml 细胞，加入不同浓度的小檗胺，总体积200μl，培养48h后，每孔加入1mg/ml MTT 工作液50μl，37℃放置4h，离心2 000r/min，5min，弃上清，每孔加入150μl DMSO，震荡溶解结晶，在波长570nm比色，求出半数抑制浓度IC50及生长抑制曲线。正常对照采用健康人外周血Ficol分离液分离的单个核血细胞。    1．5   细胞凋亡检测    Jurkat细胞经药物不同处理后，取1×10５/ml细胞悬液1ml用磷酸盐缓冲液洗2次后，加入缓冲液490μl、Annexin-Ⅴ 5μl和碘化丙锭（PI）5μl，暗处冰上反应10min，上机检测，CellQuest软件分析。另取2×106细胞，70%冰乙醇固定，24h后PBS洗2次，加入1mg/ml RNase A 200μl，37℃水浴30min，再加PI染色液避光反应30 min，上机检测10 000个细胞，Multicycle 软件分析亚二倍体峰及细胞周期。    1．6   Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态    用1mg/ml Hoechst33258 1μl孵育100μl细胞（8×10５/ml）10min，样品作细胞甩片，空气干燥后加盖玻片，Zeiss荧光显微镜观察，CCD照相。    1．7   caspase-3表达流式检测     取2×106细胞用磷酸盐缓冲液洗2次，细胞固定及破膜、荧光抗体染色按试剂说明操作，同时用鼠IgG1-FITC/PE设立阴性同型对照。上机检测。CellQuest软件分析。    1．8   统计学处理     本实验中所有数据均采用x±s表示，组间分析采用t检验。2   结   果    2．1   小檗胺细胞毒作用    小檗胺能明显抑制Jurkat细胞生长，且有浓度依赖关系。随着药物作用浓度从0.5μg/ml增加到10μg/ml，细胞存活率由93.69%降低为14.85%，在此作用浓度范围内小檗胺对正常人外周血白细胞无明显细胞毒作用（图1）。小檗胺作用48h，Jurkat细胞IC50值为6.6±0.5μg/ml。    2．2   小檗胺诱导Jurkat细胞凋亡    用荧光显微术观察正常Jurkat细胞，可见细胞核为圆形，染色均匀。在用5μg/ml小檗胺处理48h后，部分细胞发生凋亡，细胞核染色质凝集及边缘化，出现凋亡小体（图2）。           用Annexin-Ⅴ/PI双染色法定量检测表明，正常Jurkat细胞自发凋亡率低，约3.4%。5μg/ml小檗胺作用12h后，Jurkat细胞质膜磷脂酰丝氨酸（PS）外翻增多，细胞凋亡率增加为5.97%，24h细胞凋亡率为20.5%，48h细胞凋亡率增加为44.72%（图3）。24h细胞凋亡率与48h比较，差异有极显著性（P＜0.01）。    2．3   小檗胺对Jurkat细胞周期的影响    Jurkat细胞经5μg/ml小檗胺小檗胺处理48h后，出现凋亡峰（亚G1期），峰值为28.5%，同时细胞周期发生变化，G0/G1期细胞百分率由未经药物处理时的53.8%降低为35.7%，S期细胞百分率明显由未经药物处理时的41.0%增加到59.5%，G2/M期细胞百分率变化不大，分别为5.2%和4.8%。    2．4   caspase-3蛋白表达变化    未经药物处理的Jurkat细胞caspase-3蛋白表达率为1.62%，经5μg/ml小檗胺作用12h后caspase-3蛋白表达略有增加，为2.23%；作用24h后caspase-3蛋白表达率为9.83%，作用48h后caspase-3蛋白表达率为20.9%。3   讨   论    目前认为，肿瘤的发生和细胞增殖与凋亡平衡失调有关[7]。细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用，可以遏制肿瘤迅速生长。人们在肿瘤治疗的长期实践中，逐渐认识到可以通过诱导肿瘤细胞凋亡来达到治疗肿瘤的目的。    小檗胺于1980年左右作为一种升高白细胞的药物而受到研究，早期研究主要集中在对机体免疫功能的影响及其临床疗效上[1]，后来研究发现小檗胺具有抗肿瘤、抗氧化作用[4~7]，是一种钙调蛋白拮抗剂[2,3]。    小檗胺抗肿瘤作用主要表现在抑制肿瘤细胞增殖，而且此方面的研究很少[5,6]。徐荣臻等研究发现小檗胺能降低K562细胞bcr/abl融合基因表达，诱导K562细胞凋亡。本研究表明，Jurkat细胞经小檗胺作用后，能以剂量依赖关系使细胞增殖受抑制，而且细胞能形成凋亡小体和凋亡峰、细胞膜上磷脂酰丝氨酸外翻（Annexin-Ⅴ+细胞），表明小檗胺抗细胞增殖作用是通过诱导细胞凋亡实现的，这种作用具有明显的时效关系。与此同时，相同浓度小檗胺对正常人造血细胞无明显毒性作用。    许多抗肿瘤药物能使肿瘤细胞周期阻滞于某一时期，从而抑制肿瘤细胞增殖[8]。我们的研究发现，小檗胺作用后Jurkat细胞G2/M期比例明显降低，S期细胞增高，表明小檗胺对Jurkat细胞增殖抑制作用是通过诱导细胞凋亡，使细胞增殖阻滞于S期。    Caspase酶系在细胞凋亡中起关键重要作用，在促凋亡信号的作用下，一系列蛋白，如细胞色素C等可与caspase酶系结合，启动caspase级联反应，最终导致细胞凋亡[9]。研究表明随着小檗胺作用浓度增加，活化caspase-3蛋白表达增加，提示小檗胺能激活caspase酶系来诱导细胞凋亡。    小檗胺对正常人淋巴细胞没有明显毒性，但能诱导白血病细胞凋亡，可能是一种有前途的治疗白血病的药物，值得进一步研究。【参考文献】  [1] 罗崇念, 林新, 王立为, 等. 小檗胺对小鼠脾细胞毒性T淋巴细胞活性的抑制[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 1995, 9（2）：159-160.  [2] 李柏岩, 付兵, 赵艳玲, 等. 小檗胺对培养的Hela细胞内游离钙浓度的作用[J]. 中国药理学报, 1999, 20（11）:1011-1014.  [3] 李柏岩, 乔国芬, 赵艳玲, 等. 小檗胺对ATP诱导的培养平滑肌及心肌细胞内游离钙动员的影响[J]. 中国药理学报, 1999, 20（8）:705-708.  [4] 董庆华, 郑树, 徐荣臻, 等. 小檗胺对多药耐药K562/Adr细胞作用的研究[J]. 中国中西医结合杂志,2004, 24（9）:820-822.  [5] Xu R, Dong Q, Yu Y, et al. 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