环氧化酶在宫颈癌中的表达及其临床意义

作者:毕慧玲,田秀珠,王全红

作者单位：1 长治医学院附属和平医院生殖与遗传科(046000) 2 山西医科大学第一临床医学院 3 山西省肿瘤医院

     【摘要】  　　目的：研究环氧化酶（COX）在正常宫颈上皮组织宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌中的表达，探讨其与宫颈癌临床、病理特征的关系。方法：采用组织芯片技术结合免疫组织化学PV法分别检测101例宫颈癌、12例宫颈上皮内瘤变和正常宫颈上皮组织中COX-1、COX-2的表达。结果：①COX-1在正常宫颈组织、CIN及宫颈癌中的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。COX-2在正常宫颈组织中无表达，在CIN（66.7％）及宫颈癌（87.1％）中的表达率明显高于正常宫颈组织（P＜0.01），但COX-2在CIN及宫颈浸润癌中的表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。②宫颈癌中COX-1的表达与发病年龄、临床分期、病理分级、宫颈浸润深度及淋巴结转移无关（P＞0.05）；COX-2的表达与发病年龄、临床分期、病理分级及宫颈浸润深度无关（P＞0.05），而与淋巴结转移有关（P＜0.05），伴淋巴结转移者COX-2的表达较高。结论：COX-1的表达可能与宫颈癌的发生、发展无直接关系；COX-2过度表达可能参与宫颈癌的发生、发展过程，故可作为反映宫颈癌生物学行为的有效指标之一。

【关键词】  宫颈癌　环氧化酶-1　环氧化酶-2

　　The Expression of Cyclooxygenase-1 and Cyclooxygenase-2 in Cervical Carcinoma

    Bi Huiling,Tian Xiuzhu,Wang Quanhong

    Department of Reproductive and Genetic,Heping Hospital of Changzhi Medical College

    Abstract  Objective: To investigate the expression of COX in cervical carcinoma，CIN and normal cervical epithelium; To evaluate the correlation between the COXs and clinico-pathologic variables in these cervical carcinoma patients.Methods:The expression of COX-1 and COX-2, were examined by immunohistochemistry PV method and tissue chip method in 101 cases of cervical carcinomas , 12 cases of CIN and 10 cases of normal cervical epithelium.Results:①The positive expression rates of COX-1 have no significant difference between cervical carcinomas, CIN and normal cervical epithelium. COX-2 protein can not be detected in normal cervical epithelium; The positive expression rates of COX-2 in CIN (66.7％) and cervical carcinomas (87.1％) were significantly higher than in normal cervical epithelium（P＜0.01）,but there was no significant difference between CIN and cervical carcinomas（P＞0.05）.②The expression of COX-1 in cervical carcinomas has no correlation with age, clinical stages,grades,invasion deep and metastasis of lymphatic node;The expression of COX-2 in cervical carcinomas has no correlation with age, clinical stages, grades and invasion deep,but it has a correlation with metastasis of lymphatic node（P＜0.05）.Conclusion:COX-1 probably has no significant relationship with carcinogenesis and development of cervical cancer; COX-2 may play an important role in carcinogenesis and development of cervical cancer, COX-2 may be valuable to further understand the biological behavior of cervical carcinoma.

    Key words  Cervical carcinoma；Cyclooxygenase-1；Cyclooxygenase-2

    宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，是癌症造成妇女死亡的第二位原因，其发病机制迄今尚未完全

  阐明。据WHO报道每年新发现宫颈癌病例约有50万，故对宫颈癌发病机制及防治途径的研究在妇科肿瘤中占有非常重要的地位。80年代以来，一些大型流行病学调查发现，长期使用COX抑制剂（NSAIDs）治疗类风湿性关节炎的患者结肠癌发病率下降40%～60%。近年来的研究表明，COX（尤其是COX-2）与多种上皮性肿瘤的发生、发展关系密切［１］，并发现COX抑制剂在抑制肿瘤的发生、发展过程中发挥一定作用。但有关环氧化酶及其抑制剂与宫颈癌发生、发展之间关系的研究较少，因此我们采用组织芯片技术及免疫组织化学技术，分别检测了正常宫颈上皮、宫颈上皮内瘤变（CIN）及宫颈浸润癌组织中COX-1 、COX-2的表达, 并分析其与发病年龄、临床分期、病理分级、宫颈浸润深度及淋巴结转移等临床、病理特征之间的关系，以探讨COX与宫颈癌发生、发展之间的关系。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    收集2003年2月～2004年4月在山西省肿瘤医院妇产科住院手术的患者123例，其中正常宫颈组织10例（来自该院因子宫肌瘤行子宫全切术的患者），CIN 12例，宫颈浸润癌101例（鳞癌95例，腺癌6例）。宫颈浸润癌患者均有完整的临床病理资料，依据国际妇产科联盟（FIGO，1988年）临床分期标准Ⅰ期56例，Ⅱ期45例。病理分级G1～ G2期66例，G3期35例 。伴淋巴结转移者32例。所有患者均为初治，术前未行放化疗治疗，均无高血压、糖尿病、肾炎、急慢性盆腔炎及子宫内膜异位症，近期均未服用影响前列腺素和血栓素代谢的药物，年龄31岁～68岁。

    1.2  主要试剂

    COX-1、COX-2单克隆抗体及PV-6000试剂盒均为美国Zymed公司产品，购自北京中山生物技术有限公司。

    1.3  组织芯片的制作

    所有组织标本均经10％甲醛固定，石蜡包埋，切片厚5 μm，行HE染色，经山西省肿瘤医院病理科专家确诊。对选取的组织蜡块重新制作新鲜HE切片, 确定具有代表性的病变部位，在相应的蜡块上做好标记。参照Kononen等建立的方法应用打孔针制备组织芯片［２］。其方法是在一个新的空白蜡块中穿孔(直径1 mm)，在选取的组织蜡块中按照标记穿取组织柱(直径1 mm)，准确放入空白蜡块的小孔内，依次按序操作，直至将所有组织标本种植于另一空白蜡块中。应用石蜡切片机进行连续切片。

    1.4  免疫组化技术

    石蜡切片，常规脱蜡至水， 3％H2O2室温孵育10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，柠檬酸缓冲液中高压锅热修复5 min，滴加一抗（即用型），4 ℃过夜，PBS冲洗，次日滴加二抗，37 ℃孵育15　min，PBS冲洗，DAB显色后自来水充分冲洗，然后复染、脱水、透明、封片。用已知阳性片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。

    1.5  免疫组化结果判定

    阳性染色为棕黄色颗粒，特异性位于细胞核周及细胞浆内。综合染色强度和分布范围进行半定量处理，染色强度按下列标准评分：基本不着色为0分；着色淡，但明显强于阴性对照者为1分；着色清晰者为2分；着色强者为3分。分布范围按下列标准评分：阳性细胞数为0记0；＜30％为1分；30 ％～60％为2分；＞60％为3分。上述两种评分相加，0～1分为阴性，2分或以上者为阳性，其中2分为（+），3分～4分为（），5分～6分为（）［３］。

    1.6  统计方法

    采用SPSS for Window10.0软件包进行统计分析，率的比较用χ2检验或确切概率法。

    2  结果

    2.1.  COX-1及COX-2蛋白在各组宫颈上皮组织中的表达

  免疫组化检测结果显示COX-1、COX-2主要表达定位于细胞浆，为棕黄色颗粒(见图1～图4)。COX-1的表达：10例正常宫颈组织中有6例阳性表达（60.0％），12例CIN中有9例阳性表达（75.0％），101例宫颈浸润癌中有67例阳性表达（66.3％），各组间阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

    COX-2的表达：10例正常宫颈组织中均无表达（0％），12例CIN中有8例阳性表达（66.7％），101例宫颈浸润癌中有88例阳性表达（87.1％）。COX-2在CIN和宫颈浸润癌的表达率明显高于正常宫颈组织（P＜0.01），但COX-2在CIN及宫颈浸润癌的表达率相比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。表1  COX-1及COX-2蛋白在各组宫颈上皮组织中的表达

　　2.2.  COX-1及COX-2的表达与宫颈癌临床病理特征的关系

    宫颈浸润癌中COX-1的表达在不同发病年龄、临床分期、病理分级、宫颈浸润深度及有无淋巴结转移患者间相比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

    宫颈浸润癌中COX-2的表达在不同发病年龄、临床分期、病理分级及宫颈浸润深度患者间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而有淋巴结转移者COX-2的表达高于无淋巴结转移者（P＜0.05）。组织学类型中腺癌仅6例，未作统计学处理，见表3。表2  COX-1的表达与宫颈癌临床病理特征的关系表3  COX-2的表达与宫颈癌临床病理特征的关系

    3  讨论

    环氧化酶（COX）是催化膜磷脂花生四烯酸转化为前列腺素类物质（如前列腺素、血栓烷素）的限速酶，存在两种同工酶，即COX-1和COX-2。COX-1基因属于“管家基因”，在大多数正常细胞中都呈稳定表达。一般情况下活性稳定，在应激状态下或受某些激素、生长因子刺激时，其活性仅轻度增加2倍～4倍。COX-2基因属于“快速反应基因”，COX-2蛋白是诱导型酶，在静息状态下不表达，只有当细胞接受相应刺激后才开始从头合成，但其表达水平较基础水平可升高10倍～80倍不等。近年来大量研究表明，除参与炎症反应外，COX-2的过度表达与多种上皮性肿瘤的发生、发展关系密切，但具体机制尚不清楚。有人采用免疫组织化学法对宫颈癌组织中COX-2的表达进行了分析，在13例中有12例表达明显增高，而正常宫颈组织中未检测到阳性表达，而且COX-2也表达于宫颈上皮内瘤变（CIN）［４］ 。我们的研究结果显示，在正常宫颈上皮、CIN及宫颈癌组织中均有COX-1蛋白的表达，且各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明COX-1可能与宫颈癌的发生、发展无关。然而在对COX-2的检测中发现：COX-2在正常宫颈组织中无表达，在宫颈浸润癌及CIN中的阳性表达率明显高于正常宫颈组织（P＜0.01），但COX-2在CIN及宫颈浸润癌的表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。因此我们的实验结果提示COX-2的过度表达可能参与宫颈癌发生的早期过程，COX-2很可能是肿瘤发生的早期标志之一。这与国外一些学者的研究结果基本一致［５，６］。本研究结果还显示，不同发病年龄、临床分期、病理分级及宫颈浸润深度患者间COX-2蛋白的表达相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。而伴淋巴结转移者COX-2的表达高于无淋巴结转移者（P＜0.05）。这一结果表明, COX-2能提示宫颈癌具有较高转移潜能及危险性,进而可用于提示预后，因此术前活检标本中COX-2的表达水平将对宫颈癌患者术前分期及选择合理的术前治疗有一定参考价值。

【参考文献】  　　［１］ Dannenberg AJ, Altorki NK, Boyle JO, et al.Cyclooxygenase-2: a pharmacological target for the prevention of cancer. Lancet Onclol 2001,2:544～555.

［２］ Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A,et al.Tissue microarray for high- throughput molecular profiling of tumor specimens.［Ｊ］.Nat Med,1998,4 (7):844～847.

［３］ 王 敏，王欣彦，唐丽霞．环氧合酶-2蛋白在卵巢浆液性肿瘤组织中的表达及其临床意义．中华妇产科杂志，2002，37：430～431．

［４］ Kulkarni S，Rader JS, Zhang F, et al.Cyclooxygenase-2 is overexpressed in human cervical cancer. Clin Cancer Res. 2001，7(2):429～４34.

［５］ Shiotani H, Denda A, Yamamoto K, et al.Increased expression of cyclooxygenase-2 protein in 4-nitroquinoline-1-oxide-induced rat tonue carcinomas and chemopreventive efficacy of a specific inhibitor, nimesulide ［Ｊ］.Cancer Res, 2001，61:1　451～1　456.

［６］ Oshima M, Dinchuk JE, Kargman SL, et al.Suppression of intestinal polyposis in APC delta 716 knockout mice by inhibition of cyclooxygenase-2（COX-2）.Cell, 1996，87:803～809.