Ｉｒｅｓｓａ与顺铂联合抑制舌鳞癌细胞增殖的实验研究

作者：孙传政， 陈福进， 曾木圣， 李晓江， 宋立兵， 李满枝， 曾宗渊， 隋 军    作者单位：华南肿瘤学国家重点实验室∥中山大学肿瘤防治中心头颈科， 广东 广州 ５１００６０

【摘要】  【目的】 探讨ＥＧＦＲ靶向治疗药物Ｉｒｅｓｓａ与顺铂联用对舌鳞癌细胞增殖的抑制作用。【方法】 采用ＭＴＴ的方法检测Ｉｒｅｓｓａ与顺铂联用对舌鳞癌细胞系Ｔｓｃｃａ和Ｔｃａ８１１３抑制作用的效率。【结果】 Ｉｒｅｓｓａ抑制Ｔｓｃｃａ和Ｔｃａ８１１３细胞增殖的ＩＣ５０值分别为１８．０３ μｍｏｌ／Ｌ和２９．９８ μｍｏｌ／Ｌ（Ｐ＝０．００２）；Ｉｒｅｓｓａ与顺铂联用加强了对舌鳞癌细胞系Ｔｓｃｃａ、Ｔｃａ８１１３的增殖抑制，而且当Ｉｒｅｓｓａ提前２４ ｈ或４８ ｈ使用时，这种协同作用更加明显。【结论】 Ｉｒｅｓｓａ可抑制舌鳞癌细胞系Ｔｓｃｃａ和Ｔｃａ８１１３的增殖，与顺铂联用可协同抑制Ｔｓｃｃａ和Ｔｃａ８１１３的增殖，这种抑制作用具有浓度和顺序依赖性。

【关键词】  舌鳞状细胞癌； 吉非替尼； 顺铂

    Ｉｒｅｓｓａ ｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ

    Ｔｏｎｇｕｅ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ

    ＳＵＮ Ｃｈｕａｎ-ｚｈｅｎｇ１，２， ＣＨＥＮ Ｆｕ-ｊｉｎ２， ＺＥＮＧ Ｍｕ-ｓｈｅｎｇ２， ＬＩ Ｘｉａｏ-ｊｉａｎｇ１，

    ＳＯＮＧ Ｌｉ-ｂｉｎｇ２， ＬＩ Ｍａｎ-ｚｈｉ２， ＺＥＮＧ Ｚｏｎｇ-ｙｕａｎ２， ＳＵＩ Ｊｕｎ１

    （ １． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇｅｒｙ， Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０１１８， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｈｉｎａ∥Ｄｅｐａｒｔｍｅｍｔ ｏｆ Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇｅｒｙ， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ， ＳＵＮ Ｙａｔ-ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００６０， Ｃｈｉｎａ ）

    Ａｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ】 Ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｉｒｅｓｓａ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ （ＤＤＰ） ｏｎ ｔｏｎｇｕｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｉｎｅｓ Ｔｓｃｃａ ａｎｄ Ｔｃａ８１１３． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｉｒｅｓｓａ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｏｎ ｔｏｎｇｕｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｉｎｅｓ （Ｔｓｃｃａ ａｎｄ Ｔｃａ８１１３） ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＭＴＴ ａｓｓａｙ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】 Ｔｈｅ ＩＣ５０ｓ ｏｆ Ｉｒｅｓｓａ ｏｎ Ｔｓｃｃａ ａｎｄ Ｔｃａ８１１３ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｅｒｅ １８．０３ μｍｏｌ／Ｌ ａｎｄ ２９．９８ μｍｏｌ／Ｌ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ （Ｐ ＝ ０．００２）． Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｗｈｅｎ Ｉｒｅｓｓａ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ， ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ Ｉｒｅｓｓａ ｕｓｅｄ ｂｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ２４ ｈ ｏｒ ４８ ｈ． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ】 Ｉｒｅｓｓａ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｎｇｕｅ ｓｑｕｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｍａｎｎｅｒ ｏｆ ｄｏｓｅ-ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ-ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ． Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｗｈｅｎ Ｉｒｅｓｓａ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｏｎｇｕｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ； ｉｒｅｓｓａ； ｃｉｓｐｌａｔｉｎ

     头颈鳞癌的综合治疗在过去的３０年里尽管取得一些进展，但其治愈率仅从５４％提高到５９％［１］，尤其是局部晚期、复发、转移或第二原发癌的患者预后更差，这就需要积极探索新的治疗模式。近来以表皮生长因子受体?鄄酪氨酸激酶（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ?鄄ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ，ＥＧＦＲ?鄄ＴＫ）为靶点的靶向治疗不断取得进展［２，３］。ＥＧＦＲ为１７０ ＫＤ的跨膜受体，当它与配体结合后，可引起细胞

    的生长、增殖和分化，在正常的细胞生长过程中发挥重要的调控作用［４］；其在头颈部鳞癌中的过表达与肿瘤的分化程度低、晚期、降低的无复发生存率和总生存率相关，ＥＧＦＲ高表达的肿瘤恶性程度高、侵袭性强，这些特性ＥＧＦＲ在肺癌中的作用相似［５］。ＥＧＦＲ在头颈癌中的表达率国外报道为８０％ ～ １００％，国内报道在４０％～６０％。针对ＥＧＦＲ的靶向治疗药物其中一类是可口服的小分子的化合物（如Ｉｒｅｓｓａ，吉非替尼）。研究发现Ｉｒｅｓｓａ可以诱导细胞周期阻滞和凋亡、减少肿瘤新生血管的形成和抑制转移、与放化疗联用可以发挥协同作用［６］，因此积极探索ＥＧＦＲ-ＴＫ抑制剂在头颈肿瘤治疗中的价值具有一定的现实意义。

    １  材料和方法

    １．１  细胞株

    舌鳞癌细胞株Ｔｃａ８１１３和Ｔｓｃｃａ分别由上海交通大学附属第九人民医院和武汉大学口腔医学院建系，由中山大学肿瘤防治中心华南肿瘤学国家重点实验室收藏提供。

    １．２  细胞培养

    Ｔｃａ８１１３ 和Ｔｓｃｃａ均置于ＲＰＭＩ１６４０培养基（含１００ ｍＬ／Ｌ胎牛血清、链霉素０．１ ｍｇ／ｍＬ）中，在３７ ℃，饱和湿度，含体积分数５％ＣＯ２的培养箱中培养。定期换液，倒置相差显微镜下观察，待细胞接近长满培养瓶底时（约２ ～ ３ ｄ），用０．２５％胰蛋白酶消化传代。胎牛血清为杭州四季青公司产品；倒置相差显微镜为Ｏｌｙｍｐｕｓ产品。

    １．３  Ｉｒｅｓｓａ和ＤＤＰ处理细胞

    Ｉｒｅｓｓａ（吉非替尼）为ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ公司产品；ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（顺铂，ＤＤＰ）为Ｆａｕｌｄｉｎｇ公司产品。将在培养箱中培养２４ ｈ、细胞已贴壁生长的９６孔板取出，吸出每孔内的培养基，加入含不同浓度Ｉｒｅｓｓａ的ＲＰＭＩ１６４０条件培养基，Ｉｒｅｓｓａ的浓度为４．６、９．１、１６．２ μｍｏｌ／Ｌ，ＤＤＰ的浓度为０．２５、０．５、１．０、２．０、４．０、８．０ μｍｏｌ／Ｌ，每孔总体积２００ μＬ，按要求时间顺序加药。每一浓度设３个复孔，对照组培养基内加细胞不加药物，空白对照孔内不加细胞只加培养基，按要求加入全部药物后继续在培养箱中培养４８ ｈ。

    １．４  ＭＴＴ比色试验

    溴化二甲噻唑二苯四唑氮［３-（４，５-ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ）-２，５-ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ， ＭＴＴ］购自Ｓｉｇｍａ公司；酶标仪为ＢＩＯ-ＴＥＫ公司产品。细胞培养４４ｈ后加入浓度为５ ｍｇ／ｍＬ 的ＭＴＴ溶液 ２０ μＬ／孔，反应４ｈ后吸净孔内液体，每孔加入ＤＭＳＯ（二甲基亚砜，Ａｍｒｅｓｃｏ公司产品）１００ μＬ振荡１０ ｍｉｎ，上酶标仪测定波长为５７０ ｎｍ时的吸光值。实验重复３次，取３次实验结果的平均值作为最终实验结果。以时间为横轴，细胞增殖抑制率为纵轴，绘制细胞生长曲线。按下列公式计算肿瘤细胞增殖抑制率：

 １．５  统计方法

    采用ＳＰＳＳ１０．０统计软件，配对样本均数间的比较采用配对样本Ｔ检验，多个样本间均数的比较用单因素方差分析，以Ｐ ＜ ０．０５为差异有统计学意义。

    ２  结  果

    ２．１  Ｉｒｅｓｓａ单药对舌鳞癌细胞株增殖抑制作用

    Ｉｒｅｓｓａ单药对舌鳞癌细胞株Ｔｓｃｃａ、Ｔｃａ８１１３均有明显的增殖抑制作用，这种作用呈剂量依赖性。Ｉｒｅｓｓａ抑制Ｔｓｃｃａ和Ｔｃａ８１１３细胞增殖的ＩＣ５０值分别为１８．０３ μｍｏＬ／Ｌ和２９．９８ μｍｏｌ／Ｌ。

    ２．２  Ｉｒｅｓｓａ与ＤＤＰ联用的效应

    本研究发现Ｉｒｅｓｓａ与ＤＤＰ同时联用（图１）、Ｉｒｅｓｓａ 作用２４ ｈ后再与ＤＤＰ联用（图２）、Ｉｒｅｓｓａ作用４８ ｈ后再与ＤＤＰ联用（图３）均加强了Ｉｒｅｓｓａ对Ｔｓｃｃａ的增殖抑制作用，当Ｉｒｅｓｓａ提前２４ ｈ或４８ ｈ使用时，这种协同作用更加明显；而且在每组实验中随着Ｉｒｅｓｓａ或ＤＤＰ浓度的增加对Ｔｓｃｃａ的增殖抑制作用逐渐增强。

    ２．３  Ｉｒｅｓｓａ与ＤＤＰ联用对Ｔｓｃｃａ细胞系的作用

    本研究发现Ｉｒｅｓｓａ与ＤＤＰ同时联用（图４）、Ｉｒｅｓｓａ作用２４ ｈ后再与ＤＤＰ联用（图５）、Ｉｒｅｓｓａ作用４８ ｈ后再与ＤＤＰ联用（图６）均加强了Ｉｒｅｓｓａ对Ｔｃａ８１１３的增殖抑制作用，当Ｉｒｅｓｓａ提前２４ ｈ或４８ ｈ使用时，这种协同作用更加明显；而且在每组实验中随着Ｉｒｅｓｓａ或ＤＤＰ浓度的增加对Ｔｃａ８１１３的增殖抑制作用逐渐增强。其抑制作用曲线均与Ｉｒｅｓｓａ与ＤＤＰ联用对舌鳞癌细胞系Ｔｓｃｃａ的作用曲线类似。

    ３   讨   论

    由于解剖位置的关系，所以存在一定比例的头颈鳞癌患者在确诊时已无根治性手术或放疗的机会，而化疗的疗效又难以让人满意，因此当针对ＥＧＦＲ的靶向治疗药物Ｉｒｅｓｓａ开始用于ＮＳＣＬＣ的临床研究时，即开始了对其治疗ＨＮＳＣＣ的临床和基础研究。本研究发现Ｉｒｅｓｓａ单药对舌鳞癌细胞株Ｔｓｃｃａ、Ｔｃａ８１１３均有明显的增殖抑制作用，这种抑制作用呈剂量依赖性。其增殖抑制作用可能是通过以下两条途径，即低浓度诱导Ｇ０／Ｇ１期阻滞、高浓度诱导凋亡来完成的（另文待发），这与多位学者发现的Ｉｒｅｓｓａ抑制肺腺癌的增殖机制相一致［７，８］。

    研究发现ＥＧＦＲ外显子突变与Ｉｒｅｓｓａ治疗ＮＳＣＬＣ的疗效密切相关［２，３］，所以，ＥＧＦＲ１８ ～ ２１号外显子突变的检测可初步预测Ｉｒｅｓｓａ治疗ＮＳＣＬＣ的疗效。体外重建突变ＥＧＦＲ，它在ＥＧＦ配体的诱导下和野生型ＥＧＦＲ相比，急剧地增加了抗凋亡的能力［９］；用Ｉｒｅｓｓａ或用ｉＲＮＡ技术抑制突变ＥＧＦＲ，则导致肿瘤细胞迅速凋亡。对Ｉｒｅｓｓａ治疗头颈鳞癌疗效的预测的分子标记物却知之甚少［１０］，目前的研究尽管发现在头颈鳞癌中存在类似ＮＳＣＬＣ中ＥＧＦＲ外显子１８ ～ ２１突变的报道［９］，但还没有支持ＥＧＦＲ突变可以预测其疗效的报道，最近研究发现ＥＧＦＲ家族的其他成员以及边缘细胞（ｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）可能在Ｉｒｅｓｓａ对ＨＮＳＣＣ治疗的疗效方面发挥了作用［１０，１１］。Ｔｓｃｃａ、Ｔｃａ８１１３两个舌鳞癌细胞系ＥＧＦＲ基因１８ ～ ２１号外显子除２０号外显子存在同一位点的同一突变外，即２３６１Ｇ-Ａ，Ｑ７８７Ｑ，该突变没有导致氨基酸的改变故为无义突变，１８ ～ ２１外显子未见活化突变（另文待发），这表明无活化突变的细胞系Ｔｓｃｃａ和Ｔｃａ８１１３，Ｉｒｅｓｓａ仍然可以诱导其发生Ｇ０／Ｇ１期阻滞和凋亡，表明头颈鳞癌与ＮＳＣＬＣ一样，至少ＥＧＦＲ１８ ～ ２１外显子的活化突变不是Ｉｒｅｓｓａ有效的唯一前提，这与大样本的ＮＳＣＬＣ研究结果相一致，Ｋｗａｋ等［１２，１３］发现Ｉｒｅｓｓａ治疗有效者中只有５０％存在这类突变，而ＥＧＦＲ突变者中也只有４６％对Ｉｒｅｓｓａ敏感。

  本研究发现Ｉｒｅｓｓａ与ＤＤＰ联用加强了Ｉｒｅｓｓａ对Ｔｓｃｃａ和Ｔｃａ８１１３的增殖抑制作用，而且当Ｉｒｅｓｓａ提前２４ ｈ或４８ ｈ使用时，这种协同作用更加明显。这与Ｂｏｎｎｅｒ等［７］的研究结果一致，Ｂｏｎｎｅｒ等将Ｉｒｅｓｓａ和放疗或ＤＤＰ-５Ｆｕ联用也发现Ｉｒｅｓｓａ先于放疗时产生最好的效果，Ｉｒｅｓｓａ和ＤＤＰ-５Ｆｕ联用具有协同作用，当Ｉｒｅｓｓａ先于ＤＤＰ-５Ｆｕ使用时得到最好的细胞毒性效果，进一步研究发现二者联用可以协同通过线粒体和肿瘤坏死因子受体-配体两条途径诱导肿瘤细胞的凋亡；由于ＤＤＰ-５Ｆｕ可诱导ＤＮＡ修复通路ＤＮＡ-ＰＫ的上调，而Ｉｒｅｓｓａ与其联用可下调ＤＮＡ-ＰＫ的表达，这可能与Ｉｒｅｓｓａ对化疗和放疗增敏作用有关，所以这些研究结果支持Ｉｒｅｓｓａ与ＤＤＰ-５Ｆｕ的联用［８］。Ｍａｇｎｅ等［１４］研究发现Ｉｒｅｓｓａ可以增加ＤＤＰ、ＣＢＰ、Ｔａｘｏｌ、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、ＡＤＭ的抑瘤效果，Ｉｒｅｓｓａ与ＤＤＰ／５-Ｆｕ联用对头颈鳞癌细胞系的疗效具有顺序依赖性，当其先于化疗药物使用时可获得更好的效果；但这与Ｚｈｕ［１５］对肝细胞癌在荷瘤鼠进行的体内实验结果不同，他们发现当Ｉｒｅｓｓａ后于顺铂使用时可以加强化疗药物对移植瘤的增殖抑制作用，这种差异可能与不同的肿瘤细胞株类型有关。

    总之，本研究发现Ｉｒｅｓｓａ可以抑制无ＥＧＦＲ１８ ～ ２１外显子活化突变的舌鳞癌细胞的增殖，其与ＤＤＰ联用可以发挥协同作用，而且具有一定的顺序和浓度依赖，其作用机制和预测其在头颈鳞癌治疗中的疗效仍有待研究。

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