肾癌Ｇ２５０抗原基因在ｓｐ２／０细胞中的表达及其意义
发表时间：2009-06-24 浏览次数：689次
作者：张亚东， 吴荣佩， 刘 雷， 李乐军， 曹开源， 李晓飞 作者单位：中山大学 １． 附属第一医院泌尿外科， ２． 临床检验标准化中心， 广东 广州 ５１００８０
【摘要】 【目的】 将Ｇ２５０抗原ｃＤＮＡ片段转染入ｓｐ２／０细胞中并获得稳定表达，为Ｇ２５０基因疫苗研究提供实验工具。【方法】 用脂质体转染法将鉴定好的重组质粒转染入ｓｐ２／０细胞中，经Ｇ４１８筛选得到稳定表达，采用逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ-ＰＣＲ） 、间接免疫荧光、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测Ｇ２５０基因在ｓｐ２／０细胞中的表达。【结果】 转染２周后，筛选出阳性ｓｐ２／０细胞克隆，通过ＲＴ-ＰＣＲ证实有Ｇ２５０ｍＲＮＡ转录，间接免疫荧光可以见到阳性细胞，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实有Ｇ２５０抗原表达。【结论】 建立了稳定表达Ｇ２５０抗原的肿瘤细胞模型，为研究基于肾癌Ｇ２５０基因的肿瘤基因疫苗治疗奠定了基础。
【关键词】 肾细胞癌（ＲＣＣ）； Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ（Ｇ２５０）抗原； 基因表达
Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｇ２５０ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｇｅｎｅ
ｉｎ ｓｐ２／０ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ
ＺＨＡＮＧ Ｙａ-ｄｏｎｇ１，ＷＵ Ｒｏｎｇ-ｐｅｉ１， ＬＩＵ Ｌｅｉ１， ＬＩ Ｌｅ-ｊｕｎ１， ＣＡＯ Ｋａｉ-ｙｕａｎ２， ＬＩ Ｘｉａｏ-ｆｅｉ１
（ １． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ， Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ；
２． Ｔｈｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ， ＳＵＮ Ｙａｔ-ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００８０， Ｃｈｉｎａ ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 Ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｇ２５０ ｇｅｎｅ， ｗｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｔ ｉｎｔｏ ｓｐ２／０ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｓｐ２／０ ｃｅｌｌｓ， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ Ｇ４１８， ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】 Ｔｗｏ ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ， ｗｅ ｇｏｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ． ＲＴ-ＰＣＲ ａｎｄ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｇ２５０ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｐ２／０ ｃｅｌｌｓ． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】 Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｇ２５０ ａｎｔｉｇｅｎ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ， ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＲＣＣ Ｇ２５０ ｇｅｎｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ； Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ ａｎｔｉｇｅｎ； ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
近年来研究发现肾癌Ｇ２５０抗原具有良好肿瘤特异性［１］，基于Ｇ２５０基因的各种单克隆抗体（ｍＡｂ）在肾癌的诊断与治疗中取得较大进展，Ｗｉｌｅｘ／Ｌｕｄｗｉｇ癌症研究院开发的一种嵌合抗体正在进行临床Ⅱ期试验［２］。我们在自行克隆了中国人肾癌Ｇ２５０抗原基因编码区ｃＤＮＡ系列、构建其真核表达质粒［３－６］的基础上，将重组质粒转染入ｓｐ２／０细胞中，经鉴定证实获得稳定表达，为肾癌Ｇ２５０基因疫苗治疗及Ｇ２５０单克隆抗体的制备奠定了基础。
１ 材料与方法
１．１ 材 料
大肠杆菌ＤＨ５α、ｓｐ２／０细胞、７８６－０细胞、已经鉴定好的重组质粒ｐｃＤＮＡ３．０－Ｇ２５０为本研究室保存。Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、反转录试剂盒（ＲＴ-ＰＣＲ）均购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；转染试剂盒，ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００，美国ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ公司产品。Ｃａｒｂｏｎｉｃ Ａｎｈｙｄｒａｓｅ ＩＸ （简称ＣＡＩＸ）ａｎｔｉｂｏｄｙ购自美国Ａｂｃａｍ公司；二抗购自英国ＫＰＬ公司；化学发光试剂为Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ产品，分Ａ和Ｂ两种试剂。
１．２ ｐｃＤＮＡ３．０-Ｇ２５０质粒的提取和纯化
取阳性菌液以１ ∶ １００接种至５ ｍＬ含１００ ?滋ｇ／ｍＬ Ａｍｐ的ＬＢ液体培养基中，３７℃振荡培养过夜，次日取出后用质粒小量抽提试剂盒制备质粒ＤＮＡ。紫外分光光度法测浓度后备用。
１．３ ｓｐ２／０细胞对Ｇ４１８的剂量-反应分析
细胞对Ｇ４１８的剂量-反应分析根据Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司推荐的方法进行。确定杀死所有细胞的Ｇ４１８浓度，用紧邻的稍高的浓度进行筛选。
１．４ ｐｃＤＮＡ３．０-Ｇ２５０转染ｓｐ２／０细胞
将４ × １０５ ～ ８ × １０５个细胞接种于２４孔板，分为阴性对照，空质粒和重组质粒组。待ｓｐ２／０细胞生长至８０％ ～ ９０％的融合度时，按ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００的转染方法把重组质粒ｐｃＤＮＡ３．０-Ｇ２５０导入ｓｐ２／０细胞中，５ ｈ后更换含１５０ ｍＬ／Ｌ胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基。２４ ｈ后，以１ ∶ ２０的比例将细胞传代至新鲜培养基。４８ ｈ后加入Ｇ４１８至终浓度３００ ?滋ｇ／ｍＬ进行筛选，对筛选出的阳性克隆进行培养。
１．５ ｓｐ２／０细胞中Ｇ２５０基因的转录
于转染２周后获取稳定表达时，分别提取已经转染和未转染的ｓｐ２／０细胞总ＲＮＡ，用蛋白核酸定量仪（Ｅｐｐｄｏｒｆ公司）进行定量。按照说明书进行逆转录，以逆转录得到的ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ 反应，引物和反应条件同重组质粒构建法［３］。同时做阳性和阴性对照。取５ ?滋Ｌ ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。
１．６ 间接免疫荧光检测阳性克隆Ｇ２５０蛋白表达
于２周后获取稳定表达时，分别取阳性和阴性克隆细胞制作抗原片，滴加用ＰＢＳ以１ ∶ １００稀释的ＣＡＩＸ抗体，４℃孵育过夜，ＰＢＳ洗３次。滴加按１ ∶ ５０稀释的荧光标记山羊抗兔ＩｇＧ，制成细胞滴片，在荧光显微镜下观察并拍照，检测稳定转染细胞目的蛋白的表达。
１．７ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表达产物
已达融合生长的成功转染ｐｃＤＮＡ３．０的ｓｐ２／０单层细胞用冷ＰＢＳ洗３次后，加入裂解液冰上裂解３０ ｍｉｎ，１２ ０００ ｇ，５ ｍｉｎ离心去除细胞碎片后，取样品与上样缓冲液混合，煮沸５ｍｉｎ，进行１０％ＳＤＳ-ＰＡＧＥ电泳，转硝酸纤维素膜。含５％脱脂奶粉ＴＢＳＴ中室温下封闭１ ｈ，随后加入兔多克隆抗体ＣＡＩＸ抗体，羊抗兔二抗，ＥＣＬ化学发光试剂检测（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。
２ 结 果
２．１ 构建的重组表达质粒的提取、鉴定
碱裂解法提取、纯化已构建好的重组质粒，分别单、双酶切后琼脂糖凝胶电泳，可见与预定位置相符条带［３］。
２．２ ｓｐ２／０细胞对Ｇ４１８的剂量-反应浓度
经测定Ｇ４１８浓度在２００ μｇ／ｍＬ时，所有的ｓｐ２／０细胞均已死亡，故筛选浓度为３００ μｇ／ｍＬ。ｐｃＤＮＡ３．０-Ｇ２５０转染ｓｐ２／０细胞经３００ μｇ／ｍＬ的Ｇ４１８ 浓度筛选后，得到有Ｇ２５０抗原表达的细胞克隆（图１）。
２．３ ＲＴ-ＰＣＲ检测Ｇ２５０基因的表达
用特异性引物对筛选后克隆细胞及阳性对照７８６-０细胞进行ＲＴ-ＰＣＲ 测定，扩增得到了一条约１ ６００ ｂｐ的特异性条带，与预定位置相符，而未经转染细胞及阴性对照细胞则均为阴性（图３）。
２．４ 间接免疫荧光检测Ｇ２５０基因的表达
阳性稳定转染克隆用ＣＡＩＸ ａｎｔｉｂｏｄｙ、羊抗兔二抗进行间接免疫荧光，证实转染Ｇ２５０基因ｓｐ２／０细胞有Ｇ２５０抗原表达（图２），而未转染则为阴性（图４）。阳性对照细胞间接免疫荧光（图５）。
２．５ Ｇ２５０抗原的Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测
ＰＶＤＦ 膜经过抗原抗体反应后曝光，可见转染重组质粒的阳性克隆细胞在５４ ｋｕ处显示宽且颜色深的条带，阳性对照７８６-０细胞同一位置也可见宽且深的条带，与预定位置相符。而阴性对照则无条带（图６）。说明重组质粒转染的阳性克隆细胞表达的蛋白质分子量为５４ ｋｕ的Ｇ２５０蛋白。
３ 讨 论
Ｇ２５０抗原是分布于细胞膜和核膜上的跨膜糖蛋白，在大多数正常组织均不表达［７］，这就为我们利用Ｇ２５０抗原作为靶点进行免疫诊断和治疗提供了强有力的支持。
将外源基因导入哺乳动物细胞我们采用了脂质体转染法，它简单有效、转染效率高、对细胞损伤小；而且具有同源性，有利于进一步的动物实验。作为间接转移技术的重要组成部分，靶细胞的选择成为人们关注的焦点，我们拟采用Ｂａｌｂ／ｃ小鼠作为实验动物， 所以选用和Ｂａｌｂ／ｃ小鼠遗传背景一致的鼠骨髓瘤细胞株ｓｐ２／０细胞作为靶细胞［８］。Ｔｏｋｕｓｈｉｇｅ等［９］选择遗传背景与实验动物相同的肿瘤细胞作为候选靶细胞， 将抗原基因转染肿瘤细胞， 形成稳定表达目的抗原的靶细胞， 攻击免疫动物使其荷瘤。由于瘤细胞表达转染的抗原， 部分模拟目的抗原的攻击作用， 建立了特异性ＣＴＬ 杀伤活性体内诱生实验模型。因此首创选择ｓｐ２／０细胞，一种小鼠骨髓瘤细胞来做Ｇ２５０抗原基因的稳定表达。它是哺乳动物细胞，可以正确的进行翻译后修饰，遗传稳定并且表达量高；另一方面，因为要对表达产物进行免疫原性分析，也为了实验具有可重复性，所以选择稳定表达方式。
１９９６年，Ｏｐａｖｓｋｙ等［１０］发现Ｇ２５０抗原的中央区域与Ｚｎ结合后具有碳酸酐酶（ＣＡ）的活性，与ＣＡ家族具有高度的同源性。因此，认为它是ＣＡ家族的异构体之一。进一步的研究已证实Ｇ２５０抗原与ＭＮ／ＣＡＩＸ抗原的基因结构相同。间接免疫荧光法是一种简单而且标准的方法，是以特异性抗原抗体反应为基础，利用荧光色素作为标记物检测未知抗原或抗体的免疫学检测方法。我们也采用了这种方法，实验中一抗采用ＣＡＩＸ抗体，这是一种兔多克隆抗体，具有结合位点能够与Ｇ２５０抗原特异结合［１１］。再用荧光素标记的二抗结合一抗，在荧光显微镜下就能看到阳性细胞。实验结果证实转染后的ｓｐ２／０细胞有Ｇ２５０抗原表达。
将含有Ｇ２５０基因的重组质粒转染进ｓｐ２／０细胞，这一表达Ｇ２５０抗原的的鼠源瘤细胞将作为研究Ｇ２５０基因疫苗的有效实验工具，为我们研究Ｇ２５０基因疫苗激发的小鼠ＣＴＬ 应答和移植瘤模型建立奠定了物质条件。目前， 我们正在进行动物实验检验其是否具有免疫保护作用。
【参考文献】 Ｐｏｔｔｅｒ ＣＰＳ， Ｈａｒｒｉｓ ＡＬ． Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ， ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ［Ｊ］． Ｂｒｉ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ２００３，８９（１）：２-７．
Ｋｅｎｎｅｔｔ ＲＨ． Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ： ＷＸ-Ｇ２５０， Ｗｉｌｅｘ／Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ［Ｊ］． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２００３，５（１）：７０-７５．
李晓飞，曹开源，徐 霖，等． 肾癌Ｇ２５０抗原基因真核表达载体的构建和序列测定 ［Ｊ］． 中华泌尿外科杂志， ２００６，１７（１）：５-８．
徐 霖，曹开源，崔蕴霞，等． 牛ｐｃＤＮＡ３-ＢＦＧＦ真核表达重组体的构建与鉴定 ［Ｊ］． 中山大学学报：医学科学版， ２００２，２３（５）：３３６-３３８．
王烈峰，汪华侨，张 革，等． 以β-淀粉样蛋白为靶的单价及二价真核表达载体的构建和表达 ［Ｊ］． 中山大学学报：医学科学版， ２００６，２７（３）：２５０-２５３，３１７．
王烈峰，汪华侨，张 革，等． ?茁-淀粉样蛋白真核表达质粒的构建及鉴定 ［Ｊ］． 解剖学研究， ２００６，２８（１）：１８-１９，３２．
Ｇｒａｂｍａｉｅｒ Ｋ， Ｖｉｓｓｅｒｓ ＪＬ， ＤＥ ｗｅｉｊｅｒｔ ＭＣ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ Ｇ２５０［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ２０００，８５（６）：８６５-８７０．
许信刚，胡建和，张彦明． 逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒Ｅ２基因在真核细胞中表达及动物免疫试验初报 ［Ｊ］． 中国农学通报， ２００５，２１（５）：２０-２３．
Ｔｏｋｕｓｈｉｇｅ Ｋ， Ｗａｋｉｔａ Ｔ， Ｐａｃｈｕｋ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ＤＮＡ-ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ［Ｊ］． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， １９９６，２４（１）： １４-２０．
Ｏｐａｖｓｋｙ Ｒ， Ｐａｓｔｏｒｅｋｏｖａ Ｓ， Ｚｅｉｎｉｋ Ｖ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ， ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｂｉｎｉｃ ａｎｇｙｄａｓｅ ｆａｍｉｌｕ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｏｎ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ［Ｊ］． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １９９６，３３（３）：４８０-４８７．
Ｂｕｉ ＭＨ， Ｓｅｌｉｑｓｏｎ Ｄ， Ｈａｎ ＫＲ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ＩＸ ｉｓ ａｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｒｅｎａｌ ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ ［Ｊ］． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２００３，９（２）：８０２-８１１．
