膀胱移行细胞癌组织ΔNp63和MDM2蛋白表达及意义

作者:张鲁伟,周荣祥

 作者单位：青岛大学医学院附属青岛市市立医院泌尿外科，山东 青岛 266011

   【摘要】  目的 探讨缺乏酸性N端反式激活区的截短型p63（ΔNp63）和MDM2蛋白在膀胱移行细胞癌（TCC）组织中的表达及其临床意义。方法 用免疫组织化学法，检测35例石蜡包埋TCC组织标本中ΔNp63和MDM2的表达，以38例正常膀胱黏膜作为对照。结果 膀胱癌组30例(83.3%)ΔNp63蛋白呈阳性表达，膀胱黏膜组7例(18.4%)呈阳性表达，两组比较差异有显著性（uc=5.75，P<0.01）。膀胱癌组15例(42.9%)MDM2蛋白呈阳性表达，膀胱黏膜组3例(7.9%)呈阳性表达，两组差异有显著性（χ2＝11.99,P<0.01）。在不同病理分级、临床分期TCC中，ΔNp63表达差异有显著性（H=21.09、14.99,P<0.01）。随着TCC病理分级、临床分期升高，ΔNp63表达明显增强，呈显著正相关（r=0.64、0.51,P<0.01）。在不同病理分级、临床分期TCC中， MDM2表达差异有显著性（χ2＝16.63,P<0.01；χ2＝6.72,P<0.05）。30例ΔNp63蛋白阳性表达TCC组织中MDM2蛋白阳性表达10例（33.3%），两者呈显著相关性（χ2=7.78，P<0.05）。ΔNp63阳性表达主要集中在低分化、浸润性TCC中，而MDM2则主要表达在高分化、浅表TCC中。结论 ΔNp63和MDM2与膀胱肿瘤的发生发展密切相关，可作为膀胱肿瘤早期诊断和判断恶性程度的参考指标。

【关键词】  膀胱肿瘤 ΔNp63 MDM2 免疫组织化学

    EXPRESSION OF ΔNp63 AND MDM2 PROTEINS IN TRANSITIONAL CELL CARCINOMA OF URINARY BLADDER    ZHANG LUWEI,  ZHOU RONGXIANG (Department of Urology, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the expression of ΔNp63 and MDM2 proteins in bladder transitional cell carcinoma (TCC) and its significance.MethodsImmunohistochemical method was used to detect the ΔNp63 and MDM2 expression in 35 TCC and 38 normal transitional epithelium samples.ResultsThe positive rates of ΔNp63 and MDM2 expression in TCC were 83.3%  and 42.9%,  respectively; in the normal control, the positive rates of ΔNp63 and MDM2 expression were 18.4% and 7.9% (χ2=11.99,P<0.01). The positive expression of ΔNp63 in poorly differentiated and advanced TCC was significantly higher than well differentiated and superficial TCC (H=21.09,14.99；P<0.01). The positive rate of MDM2 expression in well differentiated and superficial tumor was significantly higher than poorly differentiated and advanced tumor (χ2=6.72,16.63;P<0.05,0.01). There was a negative correlation between the expression of ΔNp63 and MDM2. ConclusionΔNp63 and MDM2 protein expression were involved in the occurrence and progress of urinary bladder TCC, which can be used for early diagnosis and judgement of the malignancy level of this cancer.

    ［KEY WORDS］bladder  neoplasms; ΔNp63; MDM2; immunohistochemistry

    膀胱肿瘤是人类泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其发病率呈增高趋势。近年关于癌基因的研究成为热点。为研究膀胱移行细胞癌（TCC）发生发展规律，本文应用免疫组化技术分别检测TCC组织中ΔNp63和MDM2的表达，探讨其在膀胱肿瘤发生发展中的作用及临床意义。

    1  对象和方法

    1.1  研究对象

收集2001～2004年间我院手术的膀胱移行细胞癌病理标本35例作为膀胱癌组。35例病人中，男29例，女6例；年龄34～88岁，平均64岁。WHO病理分级：G110例，G215例，G310例。UICC临床分期：Tis ～T1期10例，T2期7例，T3～T4期18例。另取同期38例前列腺增生（BPH）病人正常膀胱黏膜作为膀胱黏膜组。

    1.2  主要试剂及来源

    小鼠抗人MDM单克隆抗体（北京中山公司），ΔNp63鼠抗人单克隆抗体浓缩液（Santa Cruz公司），SP免疫组化试剂盒（通用型）、DAB显色试剂盒、EDTA抗原修复缓冲液和柠檬酸抗原修复缓冲液（福建迈新公司）。

    1.3  实验方法

    采用免疫组织化学染色法进行染色。按试剂盒说明书进行操作。一抗P63浓度为1∶100，MDM2浓度为1∶75。滴加生物素化二抗， DAB显色，梯度乙醇脱水，中性树胶封片，显微镜下观察结果。分别采用已知的阳性切片和PBS代替一抗作为阳性和阴性对照。

    1.4  结果判定

    1.4.1  ΔNp63蛋白表达  ΔNp63蛋白表达主要位于细胞核，呈棕黄色颗粒。随机选取5个高倍视野（坏死区除外），计数500个细胞，根据阳性细胞占细胞总数的百分数判定结果：阳性细胞百分数＜25%为(+)；介于25%～50%为()；>50%为()；无阳性细胞为（-）。

    1.4.2  MDM2阳性结果判定  光镜下肿瘤细胞核染成棕黄色，为免疫反应阳性细胞，有时胞浆可部分着色。双盲法每张切片中选择代表区域,400倍光镜下计数1 000 个细胞，阳性细胞数≥1% 为阳性。

    1.5  统计学处理

    应用SPSS 10.0统计学分析软件进行数据处理。数据间比较用等级秩和及χ2检验，相关性分析采用直线相关。

    2  结    果

    2.1  ΔNp63蛋白表达

    膀胱癌组30例(83.3%)ΔNp63蛋白阳性表达，其中（＋）6例，（）15例，（）9例；膀胱黏膜组7例(18.4%)呈阳性表达，其中（＋）6例，（）1例，两组差异有显著性（uc=5.75，P<0.01）。

    2.2  MDM2蛋白表达

    膀胱癌组15例(42.9%)MDM2蛋白表达呈阳性，膀胱黏膜组3例(7.9%)呈阳性表达。两组差异有显著性（χ2＝11.99,P<0.01）。

    2.3  ΔNp63、MDM2蛋白表达与TCC临床病理特征的关系

    在不同病理分级、临床分期TCC组织，ΔNp63表达差异具有极显著意义（H=21.09、14.99,P<0.01）。随着TCC病理分级、临床分期升高，ΔNp63的表达明显增强，二者呈显著正相关（r=0.64、0.51,P<0.01）。

    在不同病理分级、临床分期TCC中， MDM2的表达差异有显著性（χ2＝16.63,P<0.01；χ2＝6.72,P<0.05）。见表1。

    2.4  ΔNp63蛋白和MDM2蛋白表达的相关性 表1  不同病理分级、临床分期TCC组织中ΔNp63、MDM2的表达4

    本文30例ΔNp63蛋白阳性表达的TCC组织中，MDM2蛋白阳性表达10例,占33.3%。相关分析表明，两者呈显著相关（χ2＝7.78，P<0.05）。同时，ΔNp63阳性表达主要集中在低分化、浸润性TCC中，而MDM2则主要表达在高分化、浅表TCC中。

    3  讨    论

    近年研究表明，ΔNp63和MDM2基因在多种恶性肿瘤中过度表达[1，2]，在肿瘤的发生和发展过程中起重要作用。

    ΔNp63是p63基因的一类亚型。由于p63和p53基因在DNA结合区域具有较高的同源性，使得p63保留了结合目标DNA的序列结构[3,4]。ΔNp63不能诱导转录激活，能参与DNA 结合位点的竞争或直接与p53 或TA 型同源体结合而灭活p53 或TA 型同源体的功能，从而阻止p53 和TA 亚型所诱导的细胞周期抑制和发生凋亡[5]。HU等[6]的研究显示，ΔNp63在鳞癌病变区高表达，癌旁上皮及正常上皮亦有表达，提示ΔNp63的高表达可能是上皮肿瘤发生的早期事件。ICHARD 等[7]报道，12例正常膀胱移行上皮组织中ΔNp63表达缺失或表达极低；而在47例TCC中ΔNp63的表达却异常升高（63.8% ）。MARSHALL等[8]报道，p63在正常的膀胱移行上皮及高分化的TCC中高表达，而在中分化和低分化的TCC中则表达降低或缺失;但ΔNp63在中低分化的TCC中却仍保持表达。 童强松等[9] 报道，ΔNp63表达水平随TCC分化程度的降低和浸润程度的增强而增高。本文研究表明，ΔNp63在TCC中的表达明显高于正常的膀胱移行上皮,在低分化、浸润性(T2～T4)TCC中表达明显高于高分化、浅表性(Tis～T1) 肿瘤，差异有显著意义;相关性分析显示，ΔNp63表达强度与TCC病理 分级和临床分期呈正相关。这表明，ΔNp63蛋白的异常表达是膀胱癌组织由浅表性向浸润性发展及恶性度增高的重要原因之一。因此, ΔNp63蛋白表达的检测可作为膀胱癌细胞恶性增殖及浸润的指标。

 MDM2基因最初由DONNA等[1]从自发肿瘤鼠Balb/c3T3成纤维细胞系中鉴定出来，能促进细胞增生及肿瘤生长。在体内具有抑制野生型p53基因激活转录和抗肿瘤活性。其机制主要通过与p53形成复合物或加速其分解，抑制p53的功能,而高水平的MDM2基因产物本身也可以使p53的功能失活，对p53起负调节作用[10]。在生理状态下,该机制既可调节P53蛋白活性,又可调节MDM2基因的表达,如果两者间的平衡被打破,将影响细胞的生长状态。野生型P53蛋白的持续表达可导致细胞生长的永久抑制或凋亡,MDM2表达过强则可封闭p53介导的反式激活作用,使p53功能丧失,导致基因的不稳定及细胞增生,从而表现出癌基因蛋白的作用,参与肿瘤形成  [12,13]。最初研究发现，MDM2在一些软组织和骨肉瘤中有扩增[13]，之后，相关研究发现，MDM2在卵巢上皮性肿瘤、鼻咽癌、肺癌、宫颈癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌等肿瘤中有不同程度的表达[11，14]。目前文献有关MDM2在膀胱肿瘤中的表达强度及意义结果不一[9，15]。本研究TCC中MDM2阳性率为42.9%(15/35),与国外文献相近[12]，明显高于正常的膀胱移行上皮；MDM2在低分化、浸润性( T2～ T4)TCC组织中的表达明显低于高分化、浅表性(Tis～T1)TCC组织，在不同病理分级和临床分期肿瘤中表达差异具有显著意义。提示MDM2过度表达可能是膀胱肿瘤发生的始动因素，而不参与肿瘤的进展。这使MDM2在肿瘤的早期诊断方面更具优势。

    研究表明，ΔNp63和MDM2都与p53有密切联系。二者虽对p53的作用机制不同，但均可抑制p53功能[16，11]。从机制上看，二者在肿瘤的发生和发展中可起协同作用。本文结果表明，ΔNp63主要表达在中低分化和浸润性TCC中，而MDM2则主要表达在高分化和浅表性TCC中。表明ΔNp63主要在TCC的进展中发挥作用，而MDM2则作为TCC发生的始动因素发挥作用，在早中期TCC中两者可能共同发挥作用。因此，MDM2检测可以作为TCC早期诊断的参考指标，而ΔNp63则可以用来评价肿瘤的恶性程度和分期（级）。两者联合检测能提供更多TCC 组织生物学信息。

【参考文献】  [1]ADANYI　M, CHA C, LEWIS R, et al. MDM2 gene amplification in metastatic osteosarcoma[J]. Cancer Res, 1993, 53(1):816.

[2]REIS FILHO J S, SIMPSON P T, MARTINS A, et al. Distribution of p63, cytokeratins 5/6 and cytokeratin 14 in 51 normal and 400 neoplastic human tissue samples using TARP4 multitumor tissue microarray[J]. Virch Arch, 2003, 443:122132.

[3]YANG A, KAGHAD M, WANY Y, et al. p63, a p53 homolog at 3q2729, encodes multiple products with transactivating, deathinducing and dominantnegative activities[J]. Mol Cell, 1998,2:305316.

[4]CELLI J, DUIJF P, HAMEL B, et al. Heterozygous germline muations in the p53 homolog p63 are the cause of EEC syndrome[J]. Cell, 1999,99:143153.

[5]YANG A, CKEON. p63 and p73 :p53 mimics, menaces and more[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2000,1:199207.

[6]HU H, XIA S H, LI A D, et al. Association of p63 with proliferative potential in normal and neoplastic human keratinocytes[J]. Invest Dermatol, 1999,113:10991105.

[7]ICHARD Z R. Prognositic impact of p63 and p53 expression in upper urinary tract transitional cell carcinaoma[J]. Urology, 2004,54:10791083.

[8]MARSHALL J, CHARLES J. Loss of p63 expression is associated with tumor progression in bladder[J]. Cancer Am J Path， 2002,161:11991206.

[9]童强松,丽端,甫清,等. ΔNp63蛋白在膀胱移行上皮癌中的表达及临床意义[J]. 临床泌尿外科杂志, 2004,19(2):8790.

[10]CAHILLYSNYDER L, YANGFENG T, FRANCKE U, et al. Molecular analysis and chromosomal mapping of amplified genes isolated from a transformed mouse 3T3 cell line[J]. Somat Cell Mol Genet, 1987,13:235244.

[11]ALARCONVARGAS D, RONAI Z. p53/MDM2 the affair that never ends[J]. Carcinogenesis, 2002,23(4):541547.

[12]OLINER J D, KINZLER K W, MELTZER P S, et al. Amplification of a gene encoding a p53associated　protein in human sarcomas[J]. Nature, 1992,358(6381):8083.

[13]LADANYI M, CHA C, LEWIS R, et al. MDM2 gene amplification in metastatic osteosarcoma[J]. Cancer Res, 1993,53(1):1618.

[14]张玉江，王美芝，张海平，等. P53蛋白、EGFR和P物质在扇贝多肽保护的中波紫外线辐射无毛小鼠皮肤中的表达[J]. 青岛大学医学院学报， 2004，40(2):128130.

[15]罗波，张劲峰. 环氧化酶与Caspase3蛋白在膀胱移形细胞癌中的表达及意义[J]. 青岛大学医学院学报， 2005，41(3):235237.

[16]REIFENBERGER G, LIU L, ICHIMURA K, et al. Amplification and over expression of the MDM2 gene in a subset of human malignant gliomas without p53 mutations[J]. Cancer Res, 1993,53(12):27362739.