结肠癌细胞内吞活动中癌基因产物cortactin的作用

结肠癌细胞内吞活动中癌基因产物cortactin的作用作者：钱飞,毛勤生,朱建伟    作者单位：226001 江苏南通大学附属医院普外科    【摘要】  目的 探讨癌基因EMS1表达产物皮层蛋白(cortactin)与结肠癌细胞内吞运动的关系。方法采用共聚焦显微镜检测人结肠癌细胞株HT29细胞内cortactin与内吞过程功能蛋白Rab5及Rab11的分布情况，以及cortactin和组成性内吞标记转铁蛋白(Tfn)的关系。采用病毒转染的方法，将外源性全长cortactin及其突变体转入结肠癌细胞内，观察过表达皮层蛋白及其变异体对细胞内吞活动的影响。进一步采用Western blot和免疫荧光分析方法检测cortactin磷酸化与Tfn内吞在时间和剂量上的关系。结果cortactin与Rab5/11及Tfn在HT29细胞内共定位。当HT29细胞过表达皮层蛋白氨基端或羧基端缺失的突变体时，细胞的内吞活动受到削弱，而表达全长皮层蛋白或载体的对照组未受明显影响。同时发现cortactin的磷酸化与Tfn内吞呈时间和剂量依赖关系。结论 cortactin在结肠癌细胞HT29的内吞活动中发挥作用，其功能的发挥可能依赖其氨基端和羧基端结构区域。在内吞过程中，皮层蛋白发生磷酸化。    【关键词】  结肠癌,皮层蛋白,细胞内吞0  引言    结肠癌是主要的消化道恶性肿瘤，其发病率在我国逐年上升。尽管各种治疗方法在不断改进，但其预后始终不太理想。究其原因，主要是对结肠癌的浸润和转移缺乏强有力的干预。近来的研究发现，与所有的恶性肿瘤一样，在结肠癌浸润和转移过程中，侵袭性伪足(invadopodia)的形成发挥了非常重要的作用[1]。细胞通过侵袭性伪足附着于细胞外基质并产生溶解细胞的物质突破基质屏障向周围侵袭[2]。细胞的内吞作用在此过程中发挥重要作用[3²5]，因此,以癌细胞内吞活动为切入点,将有助于理解癌细胞侵袭性伪足的作用过程及转移机制。然而到目前为止，有关结肠癌细胞内吞过程的机制还不清楚。有研究表明，癌基因EMS1的表达产物cortactin（皮层蛋白）对细胞内吞活动的实现起关键作用 [6] ，但该分子在结肠癌细胞内吞活动中的作用如何尚未见研究报道。本实验通过分析结肠癌细胞中皮层蛋白与癌细胞内吞的关系，发现cortactin的表达影响结肠癌细胞的内吞活动。cortactin的氨基端和羧基端对于cortactin在内吞过程中发挥功能起关键作用。同时发现cortactin在结肠癌细胞的内吞过程中发生磷酸化。本文对此作首次报道。1  材料和方法　　1.1  材料　　1.1.1  细胞株  选用人结肠癌细胞株HT29 (来自ATCC)。　　1.1.2  抗体和试剂  一抗兔抗人cortactin单克隆抗体（美国Upstate公司），鼠抗人Rab5/11单克隆抗体（美国Sigma公司）。罗丹明标记的马抗兔、荧光素标记的马抗鼠及抗转铁蛋白（Tfn）抗体（购自美国Sigma公司），cortactin磷酸化多克隆抗体（由美国马里兰大学X.Zhan实验室制备）。ELISA试剂盒（美国Sigma公司）。细胞转染试剂Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司。　　1.1.3  重组质粒  以人全长cortactin cDNA为模板设计引物并作PCR，将全长cortactin cDNA、氨基端1～80aa缺失及羧基端SH3缺失片段分别克隆到逆转录病毒载体MGIN，构建重组质粒。重组质粒由美国马里兰大学Zhan试验室惠赠。　　1.2  方法　　1.2.1  细胞培养  人结肠癌细胞株HT29以10％小牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃、5 ％CO2条件下常规培养。取对数生长期细胞进行实验。　　1.2.2  共聚焦显微镜检测  结肠癌细胞接种于放置盖玻片的6孔板内，应用完全培养基培养过夜。次日以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞1次，以4％多聚甲醛在室温下固定30min，滴加一抗作用, 4℃过夜，次日用PBS洗涤细胞3次，应用荧光标记的二抗在室温下作用2h，再以PBS洗涤3次，缓冲甘油封片，至共聚焦显微镜下观察。　　1.2.3  细胞蛋白提取与Western blot  结肠癌细胞以PBS洗涤2次，加入细胞裂解液(50mmol／L Tris．HCl、100mmol／L NaCl、2mmol／L EDTA、1％ SDS与蛋白酶抑制剂)。将细胞裂解液作变性聚丙烯酰氨凝胶垂直电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，以5％ 的脱脂奶粉封闭(20mmol／L Tris²HCl、150mmol／L NaCl和0.1％ Tween²20)。加入一抗4℃过夜，洗涤3次后，加入HRP标记二抗室温下1h，采用ECL试剂显影。　　1.2.4  病毒转染及稳定表达重组质粒的细胞筛选  将重组病毒质粒和Lipofectamine2000混合转染GPG293包装细胞，并在转染后24～72 h收集病毒上清液，将病毒上清感染HT29细胞并用G418筛选，获得稳定表达重组质粒的细胞株。　　1.2.5  ELISA测定  将细胞以1%BSA的无血清1640培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养30min,然后加入生物素标记的转铁蛋白（bio²Tfn）置于冰上30min。然后将细胞置于37℃ 5min，置于冰上终止细胞内吞活动。用封闭缓冲液（1%BSA，1%TritonX²100，10mM Tris²HCl,pH7.5,0.1% SDS,1mM EDTA,50mM NaCl）将细胞裂解，再将细胞裂解物加到包被有抗²Tfn抗体的96孔ELISA板上，4℃孵育12h，每孔中加入HRP标记二抗作用1h，加入显色剂，最后检测OD450值。　　1.2.6  统计学方法   　　采用Stata7.0软件，作方差分析， P＜0.05为差异有统计学意义。2  结果　　2.1  结肠癌细胞内cortactin与Rab5和Rab11及内吞的转铁蛋白颗粒的定位关系   Rab蛋白家族是调控真核细胞囊泡运输的主要蛋白质，Rab5主要负责调控细胞内吞过程中胞吞泡与初级内体的融合，Rab11主要定位于循环内体。我们在共聚焦显微镜下观察发现：结肠癌细胞内cortactin呈彗星尾状（红色）与Rab5/11蛋白（绿色）相互关联，见图1。同样，在吞噬FITC标记的Tfn的结肠癌细胞内，cortactin呈彗星尾状与Tfn发生共定位，见图2。　　2.2  癌细胞过表达外源性cortactin及其变异体对Tfn内吞的影响    cortactin分子由5个重要的功能区组成，包括氨基端的1～80aa区域、羧基端SH3结构域等,见图3。为进一步研究cortactin分子如何与结肠癌细胞的内吞活动发生关系，我们设计了cortactin的突变体，包括氨基端缺失(ND)、羧基端缺失(SD)突变，将全长cortactin WT及突变体编码cDNA克隆到带绿色荧光蛋白(GFP)的病毒载体 MGIN，并转染结肠癌细胞HT29获得稳定表达重组质粒的细胞株。细胞分成四组：WT组（表达全长cortactin），ND组（表达N端1～80aa缺失cortactin变异体），SD组（表达C端SH3缺失的cortactin变异体），MGIN组（空载体，作为对照）。为观察癌细胞的内吞活动，一方面，我们将癌细胞与带红色荧光标记物的转铁蛋白发生作用，在荧光显微镜下观察癌细胞内的Tfn颗粒的数量以及与cortactin的相互关系；另一方面，我们将癌细胞与生物素标记的Tfn发生作用，并以ELISA法检测不同细胞内吞的Tfn数量，以评价细胞的内吞活动的变化情况。　　a:cortactin;b:Reb 5;c:Merge;d:cortactin;e:Rab 11;f:Merge　　图1  cortactin呈彗星尾状与Rab5/11共定位于细胞浆（略）　　Fig 1  cortactin like comet tail was observed co²localized with Rab5/11 in cytoplasin　　a:cortactin;b:Tfn 5;c:Merge（略）　　图2  彗星尾状的cortactin与FITC标记的Tfn共定位于细胞浆（略）　　Fig 2  cortactin like comet tail was co²localized with transferrin labelled by FITC in cytoplasm　　图3  cortactin的分子结构示意图（略）　　Fig 3  Molecular constitution of cortactin    共聚焦显微镜观察结果显示， 表达全长cortactin的结肠癌细胞内，外源性cortactin（绿色，见图4a）与癌细胞内吞的Tfn（红色，见图4a）相互关联；而在表达cortactin突变体的细胞内，突变体cortactin分子和内吞的Tfn不发生关联，与全长cortactin不同。ELISA法检测各组细胞Tfn内吞量，WT组与MGIN组细胞Tfn内吞量均较多，且数量相似，差异无统计学意义(P>0.05)；ND组和SD组与WT和MGIN组相比较细胞Tfn内吞量显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5。实验结果提示，cortactin的氨基端和羧基端对于cortactin在内吞过程中发挥功能起重要作用。　　2.3  cortactin在Tfn内吞过程中发生磷酸化，并呈现时间和剂量依赖关系   采用Western blot方法从蛋白水平检测cortactin磷酸化与Tfn内吞活动之间的关系。图6显示，随着细胞内Bio²tfn数量的增多，cortactin磷酸化的量逐渐增多。另一方面，随着内吞活动的延长，cortactin磷酸化的量逐渐增多，细胞内吞的转铁蛋白量也逐渐增多。　　a:cortactin(WT);b:cortactin(ND);c:MGIN;d:cortactin(SD)　　green was cortactin labelled by GFP,red wast Tfn labelled by red fluorescence　　图4  表达全长cortactin和突变cortactin的结肠癌细胞转铁蛋白(Tfn)的内吞情况（略）　　Fig 4  Transferrin uptake in cells expression whole cortactin or mutational cortactin　　*：与MGIN组比较P>0.05,**：与MGIN组比较P<0.05　　图5  ELISA法检测各组结肠癌细胞Tfn内吞量（略）　　Fig 5  Transferrin uptake in each group of colon cancer　cells was analyzed by ELISA　　The level of cortactin phosphorylation was increased when　transferrin uptake in a time²and dose²dependent manner　　图6  cortactin磷酸化蛋白印迹分析结果（略）　　Fig 6  The results of cortactin phosphorylation analyzed by Western blot    同时，我们采用免疫荧光的方法观察了癌细胞内吞活动中cortactin磷酸化的情况。图7显示，30μg/ml Tfn处理的细胞内cortactin磷酸化水平比10μg/ml Tfn处理细胞内的cortactin磷酸化水平增高。当没有Tfn处理时，cortactin磷酸化较少,见图8。研究结果提示，cortactin在结肠癌细胞内吞过程中发生磷酸化改变，cortactin的磷酸化是否为癌细胞的内吞活动必须的事件，值得进一步探讨。3  讨论  　在恶性肿瘤的浸润和转移过程中，侵袭性伪足的形成发挥了非常重要的作用。癌细胞通过侵袭性伪足附着于细胞外基质并产生溶解细胞的物质突破基质屏障向周围侵袭。侵袭性伪足发挥作用与癌细胞的内吞活动有密切关系。癌细胞在侵袭过程中通过内吞活动传递有关细胞内外的分子信号。因此将癌细胞的内吞活动作为研究的切入点将有利于我们认识癌细胞的侵袭过程。网格蛋白介导的细胞内吞是细胞摄取营养至胞内以及转导胞内外信号的重要途径。这一过程大致分为四个基本步骤：（1）配体与膜受体结合形成一个细胞膜小窝(pit); （2）小窝逐渐向内凹陷。脱离细胞膜形成一个包被小泡;（3）包被小泡解聚, 形成初级内体;（4）初级内体与溶酶体融合,吞噬的物质被溶酶体的酶水解；内体以出芽形式形成运载受体的小囊泡，返回细胞质膜[7²10]。近来研究表明，细胞的内吞过程必须有细胞内肌动蛋白(actin)聚合活动的参与，而皮层蛋白cortactin在细胞内肌动蛋白的聚合过程中发挥重要作用[7，11]。这些发现促发我们对cortactin在内吞过程中作用的研究设想。　　图7  结肠癌细胞在不同数量的Tfn处理后，cortactin磷酸化水平的变化（略）　　Fig 7  The level of cortactin phosphorylation was changed　after the colon cancer cells were treated with transferrin　　图8  对照组，无Tfn处理时，cortactin磷酸化水平低下　　Fig 8  Control group,without being treated with transferrin,the level of cortactin phosphorylation was lower    在肿瘤的进展过程中，癌基因及其编码蛋白发挥重要作用。皮层蛋白cortactin由癌基因EMS1编码，同时，cortactin也是癌基因Src的主要作用底物,cortactin在Src信号途径发挥特殊功能[12]。研究表明，cortactin在结肠癌细胞中表达，对癌细胞的运动发挥作用[13²14]。我们的结果发现其存在共定位现象，cortactin表现为彗星尾状与Rab5/11或Tfn相互关联。Rab蛋白家族是调控真核细胞囊运输的主要蛋白质，属于RAS相关的小GTP酶，其中Rab5主要负责调控胞吞过程中胞吞泡与初级内体的融合，是早期胞吞过程中的一个重要的限速成分，Rab5a²GDI复合体是配体能够进入有被小泡所必需的结构[15²16]，Rab11定位于循环内体上，是细胞内吞过程中内体的功能元件 [17²18]。转铁蛋白(Tfn)内吞是细胞典型的内吞活动，常被用作内吞研究的模型。Tfn被细胞摄取在细胞内的位置，显示细胞内吞过程的路径。cortactin与Rab5/11及Tfn有共定位现象，提示cortactin的活动与细胞的内吞过程有一定关系。    为进一步研究cortactin在结肠癌细胞内吞中的作用，我们构建cortactin及其突变体重组质粒，用共聚焦显微镜和ELISA法检测细胞内吞Tfn的情况。结果显示cortactin羧基或氨基端缺失的突变体表达细胞，对于Tfn的内吞活动明显减少。结果提示cortactin的氨基端和羧基端对于cortactin在细胞内吞过程中发挥功能起关键性作用。    由于cortactin是癌基因Src的作用底物，Src作为一种酪氨酸激酶促使cortactin磷酸化而使cortactin传递上游信号[19]。Src信号途径在肿瘤的侵袭过程发挥重要作用[20]。由此我们推想在癌细胞的内吞活动中cortactin是否存在磷酸化变化。我们通过初步试验发现答案是肯定的。我们推测cortactin可能通过其磷酸化程度来影响结肠癌细胞的内吞作用，这值得进一步研究。【参考文献】 　［1］ Weaver AM. 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