HSP70、Caspase3在胶质细胞瘤中的表达及与肿瘤病理分级的关系

作者:郑虹,耿明

作者单位：山东大学研究生院 济南军区总医院干部四科， 山东 济南 250031

   【摘要】  目的： 观察半胱天冬蛋白酶(Caspase3) 和热休克蛋白70(HSP70)在胶质细胞瘤中的表达,探讨Caspase3,HSP70与胶质细胞瘤生物学行为和病理分级的关系。方法: 采用SP免疫组化染色法, 检测50例胶质瘤组织中Caspase3与HSP70蛋白的表达水平,并比较两者的相关性。结果: 随着胶质瘤病理级别的升高, HSP70的表达强度增加，而Caspase3 的表达强度减弱, Ⅰ Ⅳ级胶质瘤的HSP70阳性率分别为25%、69%、92%、100%(P<0.01),Ⅰ Ⅳ级胶质瘤的Caspase3阳性率分别为87.5%、61.5%、38.5%、31%(P<0.05)。Caspase3与HSP70表达存在负相关(P<0.01) 。结论: HSP70与Caspase3蛋白的表达结果提示,两者与胶质瘤的生物学行为和分化程度有关，又对于判断其预后有重要价值。

【关键词】  胶质细胞瘤 HSP70 Caspase3 免疫组化

    its relationship with pathological grades

    ZHENG Hong， GENG Ming

    (Graduate School of Shandong University， The Forth Department of Cadre Ward,

    Military General Hospital of Jinan Command, Jinan 250031, Shandong, China)

    ［ABSTRACT］  Objective: To explore the correlation between Caspase3 and HSP70 expressions and biologic behaviors and pathological grades of human glioma. Methods: Expressions of Caspase3 and HSP70 and their correlation in human glioma were determined by  immunohistochemistry(SP). Results: With the increase of tumor clinical grades，the positive rate of HSP70 was increased and the negative rate of Caspase3 was decreased.  Expression rates of  HSP70 were 25%, 69%, 92% and 100% in grades of ⅠⅣ and  expression  rates  of  Caspase3  were  87.5%, 61.5%, 38.5% and 31%  in grades of Ⅰ Ⅳ.  There was a negative correlation between Caspase3 and HSP70 expression.  Conclusion: Expressions of Caspase3 and HSP 70 are correlated with biological behavior and cell differentiation degrees of glioma.  They are important markers for the  evaluation of prognosis in glioma.

    ［KEY WORDS］  Glioma; HSP70; Caspase3; Immunohistochemistry    细胞应激反应和凋亡是两个进化上保守的机制，通过这两个机制相互联系形成网络，共同调节细胞的生存，使正常细胞发育和细胞稳态得以维持［1］。由应激诱导产生的热休克蛋白（heat shock proteins HSP）可以保护细胞免受应激所导致的损伤。如果应激程度超出细胞内HSP的能力，细胞则通过凋亡而结束生命。而在对凋亡机制的研究中，陆续发现了一些诱导细胞凋亡的酶类，其中Caspase是细胞凋 亡的关键分子，细胞凋亡的形态变化是系列Caspase活化并水解底物的结果。这些Caspase可被各种生理病理因素激活，呈级联瀑布式反应，而Caspase3被认为是主要的效应蛋白。如果这个平衡受到破坏，可促使细胞恶性转化，最终导致肿瘤等多种病理状态。胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见原发性肿瘤，其复发率高，治愈率低，预后很差。本文应用免疫组化方法检测50例胶质细胞瘤手术标本中HSP70、Caspase3的表达，分析二者与肿瘤增殖、凋亡和细胞分化的关系。

    1  材料和方法

    1.1  材料  收集来自济南军区总医院病理科1999 2005年间诊断为胶质细胞瘤的手术存档标本共50例。按2000年WHO制定的神经系统肿瘤分类和分级标准分为: Ⅰ级8例, Ⅱ级13例, Ⅲ级13例, Ⅳ级16例。其中男性31名,女性19名,年龄4 67岁,平均36.7岁。

 1.2  主要试剂  鼠抗人Caspase3单抗,鼠抗人HSP70 单抗,SP免疫组化试剂盒为北京中杉金桥生物技术有限公司的产品,3%双氧水,抗原修复液(枸缘酸,枸缘酸钠),0.1MPBS,DAB(显色剂)。

    1.3  方法  采用SP法,石蜡切片脱蜡至水,3%双氧水室温孵育5 10?min,微波修复抗原20?min。10%正常山羊血清封闭，室温孵育60?min。倾去血清,加1∶100稀释的Caspase3、HSP70 一抗, 4?℃过夜。PBS冲洗5?min×3次,滴加生物素化二抗工作液, 室温孵育20?min。PBS 冲洗5?min×3次。加入适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素,室温孵育20?min,PBS冲洗5?min×3次。DAB显色液显色。苏木素衬染3?min。自来水充分冲洗,酒精水化,二甲苯透明,中性树胶封片。

    1.4  结果判断与统计处理  结果分为阳性和阴性两级。阳性结果判定:HSP70、Caspase3 阳性表达呈棕黄色颗粒,位于癌细胞核和(或)细胞浆内,呈灶性或弥漫分布;无阳性细胞计为(-),阳性细胞10%为(+),阳性细胞10% 50%为(+

2  结  果

    2.1  HSP70在各级胶质瘤中的表达  HSP70阳性信号主要位于癌细胞核和细胞浆内（图1），在各级胶质瘤中阳性率分别为: Ⅰ级25%, Ⅱ级69%, Ⅲ级92%, Ⅳ级100%(表1) 。应用χ2检验显示各级胶质瘤间HSP70表达有显著差异，χ2=13.231，P＜0.01。表 1  HSP70表达与临床病理分级的关系

    2.2  Caspase3在各级胶质瘤中的表达  Caspase3阳性信号主要位于癌细胞浆内（图2），在各级胶质瘤中阳性率分别为: Ⅰ级87.5%, Ⅱ级61.5%, Ⅲ级38.5%, Ⅳ级31%(表2) 。应用χ2检验显示各级胶质瘤间Caspase3表达有显著差异，χ2=8.699，P＜0.05。表2  Caspase3表达与临床病理分级的关系

    2.3  HSP70阳性等级与Caspase3阳性等级的相关性  HSP70阳性等级与Caspase3阳性等级的表达呈负相关性，有显著差异， r=－0.375，P＜0.01。即HSP70表达呈“-”“+”“+表3  胶质瘤HSP70阳性等级与Caspase3阳性等级的比较

    3  讨  论

    3.1  胶质细胞瘤  胶质细胞瘤发生于中枢神经系统白质和灰质的胶质细胞,严重危害人类生命和健康。成人胶质细胞瘤发生率约占颅内肿瘤的45%，在儿童胶质细胞瘤也是中枢神经系统内最常见的实体肿瘤之一。胶质细胞瘤具有明显的无限增殖和抗细胞凋亡的恶性表型，在胶质细胞瘤的演进过程中，细胞密度逐渐增加，核分裂象增多，细胞异型性改变明显。其分子生物学变化涉及多种癌基因的激活、扩增、高表达，抑癌基因的突变、失活以及细胞周期基因和凋亡相关基因的异常表达［2］。

    3.2  HSP70  HSP家族种类多，其中HSP70被认为是一种抗凋亡伴侣分子，可通过不同作用机制控制凋亡。正常细胞中的HSP70低水平表达，但在肿瘤细胞中HSP70呈持续高表达，而这种表达是不需要热刺激的，肿瘤发生发展中出现的营养衰竭和缺氧可作为应激条件进而引起HSP70的上调。本研究发现，在胶质细胞瘤中随着肿瘤恶性程度的增加，HSP70表达的阳性率逐级递增，具有统计学意义，提示HSP70与胶质瘤的分化程度有密切关系，因此检测HSP70在胶质细胞瘤中的表达对于判断其恶性程度、预测病人预后有重要意义。有学者认为：HSP70的高表达一方面可以介导错配蛋白的降解，协调肿瘤细胞蛋白的快速代谢平衡；另一方面介导癌基因及抑癌基因产物的构象成熟、跨膜转运，通过影响细胞增殖过程参与了细胞周期、细胞间信号转导，使肿瘤细胞得以无限增殖［3］。HSP在胚胎细胞和乳腺癌、淋巴瘤、肺癌等组织中有较高表达［4］，提示增殖活跃的细胞内蛋白质合成增强，需要较多HSP参与蛋白质活性功能的形成。HSP70高表达与肿瘤恶性程度及病人的带瘤生存期相关，其表达可作为判断预后的指标之一［5］。

 3.3  Caspase3  Caspase3是Caspase家族中最重要的成员，参与细胞凋亡过程，其导致细胞凋亡的信号传导途径最后均需通过Cspase3介导。本研究结果显示，从Ⅰ Ⅳ级胶质细胞瘤随着肿瘤恶性程度的升高，Cspase3蛋白的阳性表达逐级减弱，提示在高分化的胶质细胞瘤组织中, 细胞增殖和凋亡相互制约，相对平衡，而随着细胞分化程度的降低，细胞增殖逐渐占据主导地位，而细胞凋亡则减弱， 因此检测Caspase3的表达有助于判断肿瘤的增殖状态。

    3.4  HSP70与Caspase3的相关性  本研究结果显示，在胶质细胞瘤中HSP70蛋白与Caspase3蛋白的阳性表达呈负相关性（P＜0.01，r=-0.375）。推测在胶质细胞瘤的发生发展过程中，HSP70的高表达可能促进细胞的转化和增生，使肿瘤呈现无限制的生长及恶性程度不断增高；而Caspase3在Ⅰ Ⅳ级胶质细胞瘤中表达逐级递减，表明其活性随肿瘤恶性程度增加而受到抑制，提示HSP可以通过抑制Caspase3的活化来抑制凋亡，二者在不同分化的肿瘤中的活性表达决定肿瘤恶性程度。彭绍华等［6］研究发现，在肝癌中HSP70和Caspase3蛋白的表达强度与分化程度明显相关，分化愈差，肿块愈大，HSP70表达愈强，而Caspase3表达愈弱，反之亦然 。HSP抑制剂就是通过促进Caspase3的活化进而导致肿瘤细胞凋亡，作为肿瘤临床诊断和治疗的分子靶点，具有广泛应用前景。 因此，对不同级别胶质细胞瘤中HSP70和Caspase3蛋白的表达进行联合检测，将不仅有助于判断胶质细胞瘤恶性程度和患者的预后，对预防、治疗胶质细胞瘤也有重要价值。HSP70和Caspase3 作为胶质瘤基因治疗的新型效应分子，已引起越来越多的关注。

【参考文献】  ［1］ 费舟，章翔，甑海宁.加强胶质细胞瘤分子病理学机制研究［J］.中华神经外科疾病研究杂志，2006，5（2）：9799.

［3］ 王莉，李青，郭爱林，等.增殖核抗原、热休克蛋白70在星形胶质细胞瘤组织中的表达及意义［J］.陕西肿瘤医学，2002，10（2）：8587.

［4］ 张学席.胃癌的基础研究与临床［M］.北京：科学出版社，1996：32.

［5］ Nanbu K， Konshi I， Komstsu T， et al.Bxpression of heat shock protein 90α in human acute leukemia cells［J］. Leau Res， 1992， 16：597605.

［6］ 彭绍华，邓虹，冯德云，等.肝癌组织和的表达意义［J］.世界华人消化杂志，2004,12（4）：782784.