苦参碱对人结肠癌细胞株HT29体外侵袭 能力的抑制作用

作者:丁印鲁,唐思锋

作者单位：山东大学

     【摘要】  目的：探讨苦参碱对人结肠癌细胞株HT29体外侵袭能力及乙酰肝素酶(heparanase, HPSE)基因表达的影响。方法：HT29细胞体外培养,以0.125、0.25、0.5?mg/ml不同浓度苦参碱进行预处理48?h后,采用半定量RTPCR、Westernblot检测各组培养细胞HPSE mRNA及HPSE蛋白表达的变化,采用细胞黏附实验检测细胞黏附能力的改变,Transwell小室检测侵袭及趋化能力的变化。结果：与对照组比较,各浓度苦参碱处理组HT29细胞HPSE mRNA及HPSE蛋白的表达和细胞黏附侵袭能力均受到显著的抑制(P＜0.01),其抑制效应与药物的浓度呈正相关(组间比较P＜0.01)。结论：苦参碱能够显著抑制细胞的体外侵袭能力，其机制可能与下调HT29细胞HPSE基因表达有关。

【关键词】  结肠肿瘤 乙酰肝素酶 苦参碱 肿瘤浸润

    DING Yinlu1, TANG Sifeng1, WANG Jingyuan1, FU Qinye1, ZHANG Jianliang1, LI Zhanyuan2, LI Zhaoting2

    （Department of General Surgery,  １. Second Hospital of Shandong University， Jinan 250033, Shandong, China；

    2. Qilu Hospital of Shandong University,  Jinan 250012, Shandong, China）

    ［ABSTRACT］  Objective： To investigate the effect of matrine on the invasiveness and expression of heparanasemRNA in the human colon cancer cell line HT29. Methods： HT29 cells were subjected to matrine of different concentrations. Fortyeight hours later, the expression of heparanasemRNA was determined by semiquantitative RTPCR, and the level of HPSE protein by western blot. The effect of matrine on HT29 cells was tested by cell Matrigel adhesion assay. The chemotactic migration and the invasive ability of HT29 cells were determined by Matrigel invasion assay. Results： The expression of hepanasemRNA and hepanase protein, adhesion, chemotactic migrations and invasiveness of matrine treated HT29 cells significantly decreased compared with those of the controls(P＜0.01). The inhibitory effect was  dosedependent(P＜0.01). Conclusion： By downregulating the expression of heparanasemRNA and hepanase protein, matrine has a significant inhibitory effect on the adhesion and invasiveness of the human colon cancer cell line HT29 in a dosedependent manner within a certain range.

    ［KEY WORDS］  Colon neoplasms; Heparanase; Matrine; Invasiveness    结肠癌是我国发病率、死亡率最高的恶性肿瘤之一。尽管在手术、化疗和放疗等方面取得了一定的进展，但预后不佳，相当数量的患者最终死于癌灶的复发和转移。因此，有必要寻找其它的辅助治疗手段以提高结肠癌治疗效果。苦参碱是从豆科植物苦参的干燥根中提取的主要生物碱之一，近年来发现其能够诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖而发挥抗肿瘤作用［1，2］,并可在抗肿瘤浸润、转移方面发挥一定的作用［3］。本研究以人结肠癌细胞株HT29为实验对象,观察不同浓度苦参碱干预后乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)基因表达及癌细胞侵袭能力的改变,旨在探讨苦参碱对结肠癌侵袭转移能力的影响及作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  主要试剂  RPMI1640 (Gibico公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，胰酶、 二甲基亚砜（DMSO)、MTT均为Sigma 公司产品。Trizol ( Invitrigen公司)，MMLV逆转录酶( Promage公司), TaqDNA酶、dNTPs、和DNA Marker (上海生工生物工程服务有限公司) , HPSE鼠单抗、羊抗鼠IgG购自北京中山生物技术有限公司；PVDF膜为pharmacia产品，ECL试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司。Matrigel凝胶(BD公司) ,Transwell小室（Coster公司），聚碳酸脂微孔滤膜（Watllman公司）；PCR 扩增引物(上海生工生物工程服务有限公司合成)，苦参碱(纯度:99.9%,20?mg/支) 购自中国药品生物制品检验所。

 1.2  细胞培养及分组  结肠癌细胞株HT29由山东大学齐鲁医院贾晓青博士惠赠，单层培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，内含青霉素100?IU/ml和链霉素100?μg/ml，置于37?℃、5%CO2饱和湿度培养箱中。采用0.25%胰酶消化，待细胞处于对数增长期生长状态良好时给予不同浓度的苦参碱进行干预。苦参碱浓度设定参照刘晓燕等［3］方法，共设0.125、0.25、0.5?mg/ml 3个实验组，对照组仅加等量的培养液，各浓度组复4瓶，继续培养48?h。

    1.3  RTPCR  取不同浓度苦参碱干预的实验组HT29培养细胞,PBS漂洗2次,以Trizol试剂提取总RNA,在1%甲醛变性凝胶上电泳验证RNA完整性。RTPCR采用两步法,按试剂说明书进行。HPSE引物序列按照文献［4］设计,上游5′TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC3′,下游5′GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC3′,其扩增片段长度为585?bp。引物按要求将其浓度稀释为20?pmol/μl,按50?μl反应体系扩增。其扩增条件为94?℃预变性4?min,后转入94?℃变性30?s、63?℃退火30?s、72?℃延伸45?s,35个循环,72?℃充分延伸7?min。以管家基因β肌动蛋白(βactin)为内参照,其引物序列为上游5′CGTTGATATCCGTAAAGACC3′,下游5′TCAGTAACAGTCCGCCTAGAAG3′,扩增片段长度286?bp。取RTPCR产物20?μl加入2%的琼脂糖中（含少量溴化乙锭），电泳，分析结果。

    1.4  Westernblot  收集细胞，蛋白提取液煮沸法提取细胞总蛋白，用Lowry法测定各样品的浓度，每个样品上样30?μg，SDSPAGE蛋白电泳并将蛋白转移至PVDF膜，依次加HPSE一抗（鼠单抗）以及二抗（羊抗鼠IgG），ECL液温浴2?min，X线片曝光显影，用激光光密度图象扫描仪测定信号条带的吸光值。

    1.5  细胞黏附实验  96孔板每孔铺Matrigel 10?μg(30?μl)，置超净台内风干；用2% BSA 20?μl封阻，置37?℃培养箱中保温1?h。收集不同浓度苦参碱预处理满48?h的HT29细胞，每孔加入3×109/L个不同处理组的细胞，并使苦参碱的终浓度为0.125、0.25、0.5?mg/ml,对照组仅加等量细胞和培养液，各组复4孔。37?℃培养1?h后, PBS洗去未黏附细胞,每孔加入20?μl MTT(5?mg/ml),继续培养4?h。弃去MTT，加入150?μl DMSO,充分溶解后于酶标仪上以570?nm波长测定其吸光度(A)值。细胞黏附抑制率=(对照组A值－处理组A值)/对照组A值×100%。

    1.6  体外侵袭、趋化实验  Transwell小室为一杯状结构，杯孔直径6.5?mm；杯底由8?um孔径的聚碳酸脂微孔滤膜封闭。滤膜上均匀涂1∶5 RPMI1640稀释的人工基质Matrigel约50?μg/小室。制备好的小室用紫外线照射2h杀菌，使用前加入少量无血清的培养基水化。小室下室加入0.5?ml无血清培养24?h的NIH3T3细胞上清液，上室加入收获的细胞悬液25?μl，调整细胞浓度为2×105/ml，每组4个复孔。37?℃、5%CO2培养12?h，取出滤膜。甲醇固定后，常规HE染色过夜。随机于镜下取上、下、左、右、中心5个视野，计数穿膜细胞数，取每个视野的平均数表示肿瘤细胞的体外侵袭能力。体外趋化运动能力的测定方法与侵袭试验类似，只是侵袭小室的滤膜不用Matrigel覆盖。

    1.7  统计学处理  采用SPSS10.0软件，行单向方差分析中多组样本均数的比较（LSD法），P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  苦参碱对HT29细胞HPSEmRNA表达的抑制作用  RTPCR电泳结果（见图1），对照组和处理组均在584?bp处有特异性的HPSE基因条带,各组均出现的286?bp的基因条带为内参照βactin的扩增产物。对照组、经0.125、0.2和0.5?mg/ml苦参碱预处理组的HPSE/βactin光密度比值分别为1.38±0.13、1.06±0.12、0.86±0.10、0.40±0.08。与对照组比较,苦参碱各浓度组HPSEmRNA表达量均显著降低,且随苦参碱浓度的增加,HPSEmRNA表达量逐渐下降,组间差异有统计学意义(P＜0.01) 。

 2.2  Westernblot检测HPSE蛋白表达  各组HPSE蛋白表达情况见图2。对照组、0.125、0.25、0.5?mg/ml组的HPSE蛋白吸光度分别为7.48±2.56、5.26±2.30、3.88±1.60、1.86±0.64。与对照组比较，经苦参碱处理后，随着苦参碱浓度的增加，HT29细胞HPSE蛋白表达依次减弱，差异有统计学意义(P＜0.01)。

    2.3  苦参碱对HT29细胞黏附力的抑制作用  采用0.125、0.25和0.5?mg/ml的苦参碱预处理HT29细胞24?h后,测定其在1?h内与Matrigel的黏附功能,结果显示,与对照组比较,各实验组培养细胞黏附Matrigel的能力明显降低，各组间差异有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

    2.4  苦参碱对HT29细胞体外侵袭、趋化力的抑制作用  侵袭实验结果显示, 对照组与各实验组细胞均能够穿过铺有人工基质Matrigel的滤膜（见图3）。与对照组比较,0.125、0.25和0.5?mg/ml苦参碱组侵袭、趋化细胞数均显著减少, 差异有统计学意义(P＜0.01)；且随苦参碱浓度的增加,侵袭与趋化细胞数逐渐减少,组间差异亦有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

    3  讨  论

    恶性肿瘤的侵袭和转移涉及多个步骤,其中穿越由细胞外基质和基底膜组成的屏障是必不可少的一步［5］。该屏障主要由两种成分构成:一是结构蛋白,二是糖氨聚糖。后者的主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proglycan,HSPG)。人类乙酰肝素酶基因是1999 年被克隆出来的,其编码的蛋白质被认为是唯一能够降解HSPG硫酸肝素侧链的核苷内切酶。HPSEmRNA 在人类正常组织中的表达主要限于胎盘和淋巴器官，而在结缔组织细胞和大多数正常上皮中,极少或无表达［6，7］。HPSE基因能够促进肿瘤的浸润转移。Vlodavsky等［6］通过基因转染实验证实,将HPSE cDNA 分别导入无转移潜力的小鼠淋巴瘤细胞系Eb 和低转移潜力的黑色素瘤细胞系,结果转染细胞均有高水平的HPSE 表达,并获得高转移潜能。利用HPSE全长基因真核表达载体转染HT29细胞，可以使HT29细胞的体内外侵袭性显著增强［8］。大肠癌组织中HPSEmRNA的高表达能够促进癌细胞向肠壁深层浸润及淋巴结转移，是反映大肠癌生物学行为的标志物之一［9］。

    黏附是癌细胞侵袭的起始步骤。同类细胞间的黏附称为同质性黏附，反之则为异质性黏附。肿瘤细胞间的同质性黏附能力降低，而与细胞外基质、血管内皮细胞之间的异质性黏附增强，有助于肿瘤细胞从原发灶脱落，进而发生侵袭和转移。研究表明［10］,苦参碱可抑制CD44、CD49 等黏附分子的表达,通过抑制肿瘤细胞与内皮细胞的黏附作用从而降低肿瘤细胞的转移能力。Transwell小室具有合适的生理环境，其聚碳酸脂微孔滤膜上的Matrigel胶为大鼠ESH肉瘤的提取物，含有人生理浓度的层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、IV型胶原，与基底膜成分相似，常用来构建人工基底膜；一般正常细胞不具备侵袭穿透8?μm孔径滤膜的能力。

    彭延辉等［11］发现，苦参碱可以通过抑制DNA合成、诱导细胞凋亡、抑制端粒酶活性等多方面、多途径抑制结肠癌HT29细胞增殖，达到抗肿瘤生长作用。本研究结果表明,经不同浓度的苦参碱干预后, 培养的HT29细胞HPSEmRNA及HPSE蛋白表达情况显著降低，且呈浓度依赖性；HT29细胞与Matrigel胶的异质性黏附和侵袭、趋化能力均显著受到抑制,其抑制作用随着苦参碱浓度的增加而增强。因此推测苦参碱可能通过下调肿瘤细胞表达HPSE而抑制癌细胞和细胞外基质的黏附,降低其穿透细胞外基质和基底膜的能力,从而达到抑制肿瘤细胞侵袭转移的目的。黏附、侵袭能力的减低或废除能在相当程度上阻断肿瘤的转移，抑制HPSE基因的表达可能是一种非常有效的抗结肠癌侵袭转移的途径。

【参考文献】  ［1］ Lai J P, He X W, Jiang Y, et al. Preparative separation and determination of matrine from the Chinese medicinal plant sophora flavescens Ait by molecularly imprinted solid phase extraction［J］. Anal BioanalChem, 2003, 375(2)∶264269.

［2］ 王林中，邹典定，赵东赤. 苦参碱诱导K 562 细胞凋亡与Survivin 基因表达的相关性研究［J］. 实用中医内科杂志, 2005,19（2）:108109.

［3］ 刘晓燕，方红，腾里送，等.苦参碱抑制人恶性黑色素瘤A375细胞株的侵袭［J］. 中华皮肤科杂志, 2006,39（6）：331334.

［4］ Uno F, Fujiwara T, Takata Y, et al. Antisensemediated suppression of human heparanase gene expression inhibits pleural dissemination of human cancer cells［J］. Cancer Res, 2001, 61(21):78557860.

［5］ 高进.中国癌症侵袭与转移研究的回顾与展望［J］. 中华肿瘤杂志,2001,23(4):265268.

［6］ Vlodavsky I, Friedmann Y, Elkin M, et al. Mammalian heparanase: gene cloning, expression and function in tumor progression and metastasis［J］. Nat Med, 1999, 5(7):793802.

［7］ Hulett M D, Freeman C, Hamdorf B J, et al. Cloning of mammalian heparanase , an important enzyme in tumor invasion and metastasis［J］. Nat Med, 1999, 5(7):803809.

［8］ 刘玉，丁彦青，辛晓燕,等.乙酰肝素酶的外源性表达对大肠癌HT29细胞侵袭性的影响［J］.癌症，2005，24(12)：14271430.

［9］ 牛保华，王建军，张孝艳，等.乙酰肝素酶mRNA在大肠癌中的表达及临床意义［J］.中国肿瘤临床，2005，32（13）：735737.

［10］ Myler H A, West J L. Heparanase and platelet factor induce smooth muscle cell proliferation and migration via bFGF release from the ECM［J］. J Biochem, 2002, 131(6):913922.

［11］ 彭延辉，郝玉彬，史迎钦，等. 苦参碱对肠癌HT29细胞株增殖的抑制作用及其机制［J］.中华实验外科杂志，2005，22（11）：13531354.