肿瘤干细胞在肿瘤研究中的进展

肿瘤干细胞在肿瘤研究中的进展作者：文雪梅    作者单位：大连市第三人民医院，辽宁 大连 116033 　　【摘要】  肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中有极少量肿瘤干细胞具有启动和维持肿瘤恶性表达的潜能。找到肿瘤干细胞并了解其生物学特性，对了解肿瘤的发生、发展及转归机制，根治肿瘤、防止肿瘤复发及克服肿瘤耐药具有积极意义。文章就肿瘤干细胞研究的新进展作一综述。 　　【关键词】  肿瘤干细胞 肿瘤　　早在20世纪60年代就已经有人提出肿瘤干细胞学说，认为肿瘤组织中存在极少量干细胞样癌细胞亚群，它具有无限增殖的潜能，在启动肿瘤形成和生长中起着决定性的作用，而其余的大多数细胞，经过短暂的分化，最终死亡。肿瘤干细胞只占肿瘤细胞总数的极小比例(约为0.1%~1.0%)，具有自我更新能力，能够分化为表型不一致的癌细胞[1]，并且能够维持肿瘤的生长和扩大，这与组织中正常干细胞维持组织更新和修复损伤的机制很相似[2]。　　有学者提出肿瘤细胞起源于干细胞，认为肿瘤细胞最重要的特性是具有无限增殖能力。分化细胞已失去增殖能力或增殖能力有限，如果发生转化首先需突变获得增殖能力或永生化，而干细胞已具有此能力，只需突变获得过度增殖能力，比分化细胞需要的突变次数少，所以干细胞比分化细胞易发生转化。目前一些科学家认为肿瘤发生之前必须积累许多基因突变，而干细胞也许是能长时间存活以接受所有突变的惟一一种细胞。其他种类的细胞仅分裂几次就死亡了，而干细胞却具有罕见的几乎无限的自我更新能力。当它们分裂时，一个子细胞可完整地复制成母细胞，而另一个子细胞则走向成熟，经过短暂分化，最终死亡。1个正常细胞成为转化细胞至少发生4~7个突变，这需要几年甚至几十年时间。干细胞是一直存在的，而分化细胞则周期性更新，所以突变更容易在干细胞中累积。从这几方面的原因可以推测肿瘤细胞的突变最早发生于干细胞，干细胞是突变的靶。1   肿瘤干细胞在白血病中的研究　　肿瘤干细胞的研究最初是在白血病中取得突破，在白血病及多发性骨髓瘤中只有极少数肿瘤细胞亚群能广泛增殖。如从鼠腹水中得到的骨髓瘤细胞，在体外进行克隆实验,结果仅有1/10 000~1/100的癌细胞能形成克隆生长，这些形成克隆的白血病细胞可能就是白血病干细胞。即多数的白血病细胞不能过度增殖，而只有少数固定的细胞亚群才能不断地形成克隆。此观点由Dick在1997年证实。Bonnet等提取、纯化CD34+、CD38-表型的急性粒细胞白血病(AML)细胞，尽管这些细胞仅占全部AML细胞的0.2%，但这是惟一能够在非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(non?鄄obesediabetic&severe combined immune?鄄deficient，NOD/SCID)鼠启动人类AML和形成移植瘤的细胞。因此认为，CD34+CD38-白血病细胞可能是AML的肿瘤干细胞。Blair等也用同样方法证明，只有表型为CD34+/CD71-/HLA-DR-(human leukocyte antigen?鄄DR)的白血病细胞属于肿瘤起源细胞。随后的研究证明白血病干细胞(leukemia stem cells，LSCs)的免疫表型在许多方面与造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSC)相似，都表达CD34而不表达CD38，但HSCs中表达细胞表面抗原Thy?鄄1(CD90)和c?鄄kit(CD117)，而LSCs中则不表达。IL?鄄3受体α链(CD123)是LSCs的一个独特的标志，与人类癌细胞抗凋亡相关的NF?鄄κB的活化形态也在LSCs中表达而在正常的HSCs中不表达。体外试验抑制NF?鄄κB的活性，诱导了LSCs的凋亡，而保存了正常干细胞。所以进一步研究LSCs，不仅对靶向LSCs的治疗方法非常关键，也是了解白血病进程的一个关键因素[3]。2   肿瘤干细胞在实体肿瘤中的研究　实体瘤干细胞的纯化非常困难，因细胞表面标记很少，难以进行细胞分选。而且传统上人原代实体瘤干细胞的异种移植检测是在裸鼠中进行，这些小鼠仍然具有一定的免疫功能，会造成异种移植肿瘤形成的差异，所以有可能是小鼠的免疫排斥使人们检测不到实体瘤干细胞的存在。　2．1   乳腺癌肿瘤干细胞的研究　　2003年研究人员利用癌细胞膜表面抗原的差异，使用特异的抗体及流式细胞技术，将人类乳腺癌组织的细胞接种到NOD/SCID小鼠体内，结果证明只有一种细胞表面抗原为CD44+CD24-/low的癌细胞能在NOD/SCID鼠体内形成移植瘤，并且只需细胞数为100个即可100%形成肿瘤[4]。他们将鼠体内移植瘤传代培养形成的肿瘤进行表型分析，结果显示第一次接种后形成的肿瘤和第二次接种后形成的肿瘤表型异质性相似。证明移植后可以重建肿瘤组织的不同成分。验证了其具有再生原始肿瘤的能力及多向分化的特点。以上细胞的成功分离以及可靠的异种移植检测方法的建立，证明肿瘤中绝大多数细胞没有能力增殖或形成肿瘤，只有极少部分细胞能够无限增殖，产生更多的具有相同特点的细胞和缺乏肿瘤源性潜力的肿瘤细胞。这是首次寻找和证实实体瘤肿瘤干细胞的实验。最近，Ponti等[5]从乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中分离出肿瘤源性细胞，并在体外培养。乳腺癌细胞培养液中包含了能自我更新的未分化细胞。扩大增殖的非黏附单克隆细胞球丛，能向不同的乳腺上皮细胞系(导管细胞，肌上皮细胞)分化。表面标志为CD44+/CD24-和Cx43-的细胞过表达新生血管因子及细胞保护因子以及公认的干细胞标志物Oct-4，并且在细胞数为1 000时，注射到SCID鼠乳腺脂肪垫下即可形成新的肿瘤。因此为乳腺肿瘤源性细胞能够在体外增殖分化形成新肿瘤提供了直接证据。　2．2   脑肿瘤中肿瘤干细胞的研究　　Singh等[6]应用分离正常神经干细胞的方法自人脑肿瘤中鉴定出细胞表面标志为CD133+的具备明显增殖、自我更新及多向分化能力的肿瘤干细胞。将这一细胞表面标志为CD133+的肿瘤干细胞在NOD/SCID鼠脑内进行异种移植实验，结果证明只有CD133+的肿瘤细胞才能移植成功，且仅需100个细胞。这给实体肿瘤中存在肿瘤干细胞的假设提供了强有力的证据[7，8]。　2．3   卵巢癌中肿瘤干细胞的研究　　Bapat等[9]的研究提示，人类卵巢癌的进行性发展可能是卵巢内正常干细胞的转化与功能异常造成的。Bapat等从1例晚期卵巢癌患者腹水中直接分离得到了一个致癌性细胞克隆，在培养过程中获得了另一个发生了自发性分化的克隆，两者为疾病的进展提供了研究模型。这两个细胞克隆具有干细胞样特征，体外培养时能形成锚着不依赖性的细胞球。用两个克隆制备小鼠肿瘤模型，所得肿瘤的组织学和细胞结构都与患者原发肿瘤相似，所得肿瘤在系列移植过程中也能够形成肿瘤，证明其拥有CSC特征。　　此外，Kim等[10]在支气管与肺泡的交界处分离到了拥有干细胞特性的细胞，认为这群细胞与肺腺癌的发生有关。3   CSC与肿瘤发生的机制　3.1   CSC概念的提出为癌症机制的研究带来了新的思路　　肿瘤细胞的基本生物学行为表现为细胞的增殖与分化的失调，肿瘤细胞生长失去控制具有无限增殖能力。肿瘤的发生、发展是一个多基因、多因素、多阶段的复杂病理过程，致癌剂和遗传因素及细胞微环境共同作用于干细胞，引起生长调控途径中某些分子发生改变，造成细胞过度增殖，这可能是肿瘤发生的始动因素。其中，干细胞所处的微环境又称为壁龛(niche)，成体干细胞长期存在于各种组织内，其自我更新和分化始终受到所处微环境的影响。成体干细胞在向CSC转变的过程中，除了可以发生多次基因突变之外，干细胞所处的微环境发生变化尤其重要，因为调节成体干细胞的信息大部分是来自其微环境的。　3.2   CSC与干细胞有相似的生长调控机制　　Notch、SHH、Wnt途径是目前研究较为深入的、与细胞生长分化有关的信号转导途径，对调节干细胞自我更新、自我调控起着重要的作用，许多与正常干细胞有关的调控途径,在某些肿瘤组织中，也起着重要的调控作用。Notch基因参与早期造血功能的调节，大多数人认为Notch活化主要启动自我更新。SHH信号传导途径中PTCH基因，编码跨膜蛋白，属抑癌基因；SHH途径的激活、SHH蛋白水平过高与人类的多种癌症有关。Wnt信号通路下游效应物β连环蛋白的表达与肠上皮[11]、中枢神经系统、造血系统的干细胞自我更新密切相关。Notch细胞信号转导途径的激活[12]、Wnt信号途径的失控[13]、SHH-Gli途径的下调[14]等诸多信号转导途径与造血系统、乳腺组织及肠上皮组织的干细胞自我更新、分化失调而致恶性转化有关。　3.3   肿瘤的侵袭转移　　肿瘤的侵袭和转移是恶性肿瘤的生物学特征之一，肿瘤的侵袭是肿瘤转移的前奏。干细胞具有迁移的特性，而肿瘤细胞有转移的能力，肿瘤的生长和转移是受一小群CSC驱动的。Tu等认为，干细胞的迁移和肿瘤细胞的转移皆受特异化学因子及其受体的调节，使它们迁移到特定的组织和器官，这可以解释肿瘤转移的器官和组织特异性。4   肿瘤干细胞在治疗方面的应用　　肿瘤干细胞的分离具有重要的临床意义，传统的药物治疗是基于动物模型中药物能抑制肿瘤生长，针对的是肿瘤中的大多数细胞，而肿瘤中的绝大多数细胞不具有肿瘤源性，靶向这些细胞的治疗虽能使肿瘤缩减，但是，如果治疗不能靶向肿瘤干细胞，干细胞在治疗后仍然持续存在并且重新形成肿瘤，导致肿瘤的复发。因此越来越多的学者提出肿瘤治疗应该针对肿瘤干细胞[15]，即使肿瘤体积没有缩小，但由于其他细胞增殖能力有限，肿瘤将逐渐退化萎缩。已证明，干细胞以一定的机制，譬如通过抗凋亡bcl-2家族蛋白的高表达，膜转运蛋白的高表达抵抗化疗，这就是当前的治疗容易产生抗药细胞的原因。肿瘤干细胞分离后，通过表面标记纯化肿瘤干细胞，研究它们的基因表达模式，找到肿瘤发生过程中必需的功能蛋白，把该蛋白作为新的药物靶标来治疗肿瘤。还可以针对肿瘤干细胞的特异性抗原制备相应的抗体，让其携带化疗药物直接杀灭肿瘤干细胞，能够更有效地治疗甚至治愈肿瘤。也可以通过寻找肿瘤干细胞特殊标志，可以更早检查出肿瘤的发生，为治疗赢得宝贵的时间[16]。尽管新的针对肿瘤干细胞的特异性治疗还没有正式确立，近来已有几个研究报道了针对急性粒细胞白血病干细胞的更有效的治疗方法。例如，将白喉毒素融合到白介素3中制造出的药物可以消除原始急性粒细胞白血病细胞。另一个研究则显示针对CD44+表型的单克隆抗体可以诱导白血病干细胞的分化，抑制其在体内适宜微环境的停留[17]。最近的资料提示将传统的化疗药物和新合成的小分子药物结合起来也是靶向白血病干细胞的一个有效方法。相信不久的将来，针对实体瘤干细胞的有效的药物也会产生。5   肿瘤的耐药　　CSC是造成肿瘤耐药的最根本原因，肿瘤细胞对化疗药物的耐受性是肿瘤治疗的主要障碍。现有治疗肿瘤的方法主要是针对肿瘤组织内的大多数细胞，而不是CSC。CSC与正常干细胞具有许多相似的特征，大多处于细胞周期的G0期，表达特异性的ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)，如ABCB1、ABCG2等介导的膜泵耐药分子，使其对化疗天然耐药。ABCB1、ABCG2是从肿瘤组织中分离出来的最基本的肿瘤多药耐药基因，ABCB1编码P-gp，ABCG2编码BCRP；这些转运蛋白通过利用ATP分解产生的能量主动将细胞内的药物泵出，从而保护自身免受细胞毒性药物的损伤，对化疗不敏感，如果CSC高表达这类分子，可以将化疗药物泵出细胞，降低细胞内的药物浓度，导致肿瘤化疗后少数CSC仍然存活，这可能是肿瘤耐药、复发转移的重要机制[18]。Al-Hajj等[19]证实，CD34+CD38-白血病细胞对柔红霉素的敏感性明显低于CD34-CD38+肿瘤细胞，人LSC对阿糖胞苷的抵抗力强于其他白血病细胞，这些现象都可能与干细胞上的多种ABC转运蛋白的功能相关。Raaijmakers等研究发现，BCRP在AML中优先表达于CD34+CD38-细胞，以Ko143阻断BCRP介导的膜泵，细胞中米托蒽醌药物浓度明显增加，但体外试验Ko143却未能起到化疗增敏的作用，提示BCRP仅为LSC耐药的部分机制。最近对白血病患者格列卫(Gleevec)耐药的研究，证实了ABC转运蛋白介导干细胞的膜泵耐药机制。研究发现格列卫是ABCG2的底物和抑制物，使其更易被表达ABC转运蛋白的干细胞泵出[20]。6   展   望　　肿瘤干细胞概念的提出，提供了靶向性或选择性杀伤肿瘤干细胞的可能性，从而达到根治肿瘤、防止肿瘤复发和转移。因此目前肿瘤研究者应该进一步证实更多实体瘤肿瘤干细胞的存在，并从肿瘤中分离纯化出肿瘤干细胞，研究其特性，发现针对肿瘤干细胞的治疗方法。肿瘤干细胞概念的提出是人类认识肿瘤发病机制的一大进步，与以往所提出的肿瘤发病机制的概念并不矛盾，为研究肿瘤发病机制及根治恶性肿瘤提供了又一新的方向，可能成为肿瘤防治研究的新的突破点，现在这一研究已处于肿瘤研究的最前沿。　　虽然目前人们还不能确定CSC的来源，但有一点很明确，那就是CSC的免疫原性和治疗敏感性较差，这直接导致了肿瘤的复发和预后不良。目前尚未发现分离鉴定CSC的统一分子标志物，将来研究的重点应放在寻找识别CSC的方法，明确CSC和增殖能力有限的肿瘤细胞的差异之处，从而服务于肿瘤的分类与诊断，有选择性地确认并杀死这些生物学性状比较特殊的CSC群。【参考文献】　　[1] AI Hajj M, 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