GSTP1、MRP mRNA表达与胃癌辅助化疗预后的关系

    作者：华东，黄朝晖，邓建忠    作者单位：（苏州大学附属第四医院肿瘤研究所，江苏 无锡 214062）

    【摘要】  ［目的］ 探讨谷胱甘肽S转移酶（GST）P1、多药耐药相关蛋白(MRP)mRNA表达与胃癌铂类药物辅助化疗预后的关系。［方法］ 经病理学确诊的胃癌患者66例，采用5-Fu/铂类药物为主的方案进行辅助化疗。采用反转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测胃癌组织中GSTP1和MRP mRNA表达水平。 ［结果］ 66例胃癌患者中，MRP和GSTP1 mRNA的表达水平中位值分别为1.214和0.434。GSTP1 mRNA高表达组无复发生存率和总生存率均显著低于低表达组(P<0.05)。调整年龄、性别、分化程度、淋巴结状态、分期后，多因素分析结果显示GSTP1 mRNA水平是影响患者预后的独立危险因素(P<0.05)，而MRP表达水平与预后无关(P>0.05)。［结论］ GSTP1 mRNA表达水平可以在一定程度上判断术后胃癌患者接受铂类药物化疗后的预后。

    【关键词】  胃癌

   The Relation of GSTP1 and MRP mRNA Expression with Prognosis in Gastric Cancer Patients Treated with Adjuvant Chemotherapy

    HUA Dong, HUANG Zhao-hui, DENG Jian-zhong

    (Cancer Institute, the 4th Hospital Affiliated to Suzhou University, Wuxi 214062, China)Abstract: ［Purpose］ To investigate the relation of GSTP1 and MRP mRNA expression with the prognosis in gastric cancer patients treated with platinum-based adjuvant chemotherapy． ［Methods］ Sixty-six cases with pathologically proven gastric cancer received platinum-based adjuvant chemotherapy, and the mRNA expression of GSTP1 and MRP in gastric cancer tissues was tested by semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)． ［Results］ The median mRNA levels of MRP and GSTP1 in gastric cancer tissues were 1.214 and 0.434, respectively. The recurrence-free survival and overall survival in patients with high level of GSTP1 mRNA were significantly lower than those with low level (P<0.05). After adjusting for differentiation, staging, lymph node status, age and gender, multivariate analysis showed that GSTP1 mRNA level was an independent risk factor for prognosis (P<0.05). MRP mRNA level was not associated with relapse or survival. ［Conclusion］ The mRNA level of GSTP1 may be a useful predictor parameter for recurrence in postoperative gastric cancer patients received with platinum-based adjuvant chemotherapy．

    Subject words: gastric neoplasms; drug therapy; glutathione-S-transferase; mutidrug resistance

    药物不能与靶位点结合，从而导致肿瘤细胞耐药[5，6]。虽然国内已有关于胃癌组织中GSTP1和MRP mRNA表达的相关报道[7，8]，但关于其与胃癌辅助化疗预后的相关性研究尚未见报道。本文选择66例接受铂类药物辅助化疗的胃癌患者为研究对象，分析胃癌组织GSTP1和MRP mRNA表达水平与其预后的关系。

    1   材料与方法

    1.1   一般资料　

    收集本院2003年8月～2006年8月间收治的胃癌患者66例，年龄34～76岁，中位年龄58岁。所有病例均为行胃癌根治术后病人，并经影像学检查证实体内未测到影像学可见肿瘤病灶。化疗前患者血常规、肝肾功能均正常，心电图无明显异常。所有病例根治术后均接受4个周期以上以铂类为主的联合化疗，包括CF（亚叶酸钙）+5-Fu（氟尿嘧啶）+L-OHP方案57例，CF+5-Fu+L-OHP+TAX（泰素）方案9例。肿瘤组织学分类和分级均以全国胃癌协作病理组规定作为标准，采用2002年AJCC胃癌TNM分期标准进行分期。无复发生存期(recurrence-free survival，RFS)为根治性手术到首次复发、转移的时间；总生存期(overall survival，OS)为根治性手术到死亡或末次随访的时间。

    1.2   RT-PCR检测GSTP1和MRP mRNA表达水平

    选取这些患者手术切除的肿瘤组织，置于-196℃液氮中保存。采用总RNA提取试剂Trizol (Invitrogen公司)，依照试剂说明书，提取总RNA。电泳检测RNA质量，紫外分光光度计检测测总RNA浓度。然而将总RNA逆转录成cDNA，方法如下：取总RNA 5μg、随机六聚引物0.4μg，加无RNA酶的DEPC处理水至11.0μl，70℃ 5min后冰上骤冷；顺序加入逆转录缓冲液5×buffer 4.0μl，10mmol/L dNTPs 2.0μl，RNase inhibition 20U，加DEPC水至19μl，25℃ 5min后，每管加200U MMLV逆转录酶混匀后加一滴石蜡油，短暂离心，于25℃ 10min，42℃ 60min，70℃ 5min，4℃冷却8min。

    利用Primer3.0软件设计PCR引物（见表1）。优化后的PCR反应体系为：Mg2+ 1.5mmol/L，dNTPs 200μmol/L，引物各0.5μmol/L，热启动Taq酶1U，cDNA 2.0μl，10×缓冲液2.5μl，加DEPC水至总体积25μl。扩增条件为：94℃预孵15min；94℃变性45s、序列特异退火温度45s、72℃延伸45s，30个循环，72℃ 8min。取5μl扩增产物于2%琼脂糖凝胶上电泳分离，溴化乙啶染色后，用凝胶图象分析仪测定目的基因与内参基因β-actin的灰度比，以判断目的基因在线性扩增范围内的相对表达量。

    1.3   统计学处理

    应用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理，不同表达水平病例与临床病理特征之间的关系用χ2检验。多因素分析采用Cox比例风险模型进行。采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线，Log-Rank方法比较生存率。所有统计均采用双侧检验。以P<0.05为有统计学差异。

    2   结   果

    2.1   RT-PCR结果

    RT-PCR电泳结果见图1。所有标本β-actin均扩增成功，3例标本未扩出MRP，1例未扩出GSTP1。66例胃癌患者中，MRP和GSTP1 mRNA的表达中位值1.214和0.434，以其为界将病例分为高表达组和低表达组。GSTP1 mRNA高表达组生存率显著低于低表达组(P=0.012)，MRP高表达组生存率与低表达组间无显著差异(P=0.259)。调整年龄、性别、分化程度、淋巴结状态、分期后，多因素分析结果显示GSTP1 mRNA水平是影响患者预后的独立危险因素(P<0.05)，而MRP表达水平与预后无关(P>0.05)。

    2.2   MRP和GSTP1 mRNA水平与临床病理参数的关系

    MRP和GSTP1 mRNA水平与临床病理参数的关系，见表2。

    2.3   MRP和GSTP1 mRNA水平与胃癌患者预后的关系

    随访时间截止至2007年6月15日，共有39例（59.1％）患者出现复发，其中GSTP1低表达组和高表达组患者复发率分别为42.4％（14/33）和75.8％（25/33）；而MRP低表达组和高表达组患者复发率分别为51.5％（17/33）和66.7％（22/33）。利用Kaplan-Meier方法绘制无复发生存曲线并进行Log-Rank检验，结果见图2、3。

    66例患者中，37例（56.1％）死亡，其中GSTP1低表达组和高表达组患者死亡率分别为39.4％（13/33）和72.7％（24/33）；而MRP低表达组和高表达组患者死亡率分别为45.5％（15/33）和66.7％（22/33）。不同组患者生存曲线及Log-Rank检验结果见图4、5。将年龄，性别、分化程度、淋巴结状态、分期及MRP或GSTP1表达水平纳入Cox回归模型进行多变量分析，结果显示GSTP1 mRNA高表达是影响患者复发（OR=2.456，95%CI：1.229～4.907，P=0.011）和生存（OR=2.474，95%CI：1.211～5.057，P=0.013）的独立危险因素，而MRP表达水平与预后无关(P>0.05)。

    3   讨   论

    复发和转移是包括胃癌在内的多数恶性肿瘤患者死亡的主要原因。很多行胃癌根治术的胃癌患者，尽管术后体内不存在影像学可见的肿瘤病灶，但仍有60%的患者于2年内出现复发和转移。对具有不良预后因素的患者进行辅助化疗是降低其复发率，延长其生存期的主要手段之一。但迄今为止，包括胃癌在内的大多数恶性肿瘤的化疗疗效仍不理想。铂类药物为基础的化疗方案是常用胃癌化疗方案之一，但不同个体对铂类药物敏感性差异很大，相同的化疗方案在不同的肿瘤患者产生不同的疗效[9，10]。

    肿瘤细胞解毒能力增强，使化疗药物失活是导致耐药的另一重要机制，GST和MRP在这一机制中发挥重要作用。研究显示，GSTP1表达水平与肿瘤细胞对铂类药物的敏感性有关[1~4]。本文研究结果显示，低表达GSTP1 mRNA的胃癌患者具有更高的无复发生存率和总生存率。Cox多因素回归分析显示GSTP1 mRNA表达水平是胃癌病人接受铂类药物辅助化疗后复发及总生存的预测因子，高表达GSTP1 mRNA的胃癌患者具有更短的RFS和OS，其复发和死亡的相对风险分别是GSTP1低表达患者的2.456和2.474倍(P<0.05)；而MRP表达与患者预后无显著相关性。Kwon等[4]用免疫组化方法检测胃癌症状GSTP1的表达情况，发现GSTP1表达与晚期胃癌对5-Fu/草酸铂的疗效无关，与我们的结果不同。这可能与检测方法、病例筛选标准等差异有关。由于本研究病例数较少、随访时间较短（近一半患者生存），要全面理解GSTP1表达对接受铂类药物辅助化疗胃癌患者预后的影响，仍需进一步扩大样本量，延长随访时间。

    本文统计结果显示，GSTP1及MRP mRNA表达水平与年龄、性别、分化程度、淋巴结转移情况及临床分期均无相关性，提示GSTP1及MRP mRNA表达水平可能不是判断胃癌侵袭相关生物学行为的预测指标。

    总之，我们的初步研究结果表明，GSTP1mRNA表达水平与胃癌患者对铂类药物辅助化疗后的预后有关，有可能作为预测铂类药物对胃癌辅助化疗效果的指标，用于指导该类药物的个体化使用，以提高临床治疗的针对性和可预见性。

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[2] Okuyama T, Maehara Y, Endo K, et al. Expression of glutathione S-transferase-pi and sensitivity of human gastric cancer cells to cisplatin[J]. Cancer, 1994, 74(4):1230-1236.

[3] 陈慧君, 吴绪峰, 陈惠祯. 卵巢癌中TopoIIα、GST-π、P-gp表达与化疗反应性及预后的关系[J]. 肿瘤, 2006, 26(4):380-384.

[4] Kwon HC, Roh MS, Oh SY, et al. Prognostic value of expression of ERCC1, thymidylate synthase, and glutathione S-transferase P1 for 5-fluorouracil/oxaliplatin chemotherapy in advanced gastric cancer[J]. Ann Oncol, 2007, 18(3):504-509.

[5] Nishiyama M, Yamamoto W, Park JS, et al. Low-dose cisplatin and 5-fluorouracil in combination can repress increased gene expressions of cellular resistance determinants to themselves[J]. Clin Cancer Res, 1999, 5(9):2620-2628.

[6] Kirihara Y, Yamamot W, Toge T, et al. Dihydropyrimidine dehydrogenase, multidrug resistance-associated protein, and thymidylate synthase gene expression level can predict 5-fluorouracil resistance in human gastrointestinal cancer cells[J]. Int J Oncol, 1999, 14(3):551-556.

[7] 谢家泰, 陈宏斌, 蒋义贵, 等. 多重耐药蛋白-1在胃癌中的表达及意义[J]. 世界华人消化杂志, 2007, 15(10): 1092-1095.

[8] 姚凡, 金锋, 陈波, 等. 胃肠癌GST-πmRNA的表达及临床意义的研究[J]. 中国医科大学学报, 2004,33(1):40-41.

[9] McLead H. Individualized cancer therapy: molecular approaches to the prediction of tumor response[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2002, 2(1):113-119.

[10] Vita FD, Orditura M, Ciardiello F, et al. Adjuvant chemotherapy of gastric cancer: which regimens?[J]. Ann Oncol, 2005, 16(Suppl 4): iv102-iv10.