卵巢癌组织和血清中RASSF1A基因甲基化的检测及临床意义

作者:李其荣

作者单位：山东大学齐鲁医院妇产科， 济南 250012

    【摘要】  目的 检测卵巢肿瘤组织和血清中Ras相关区域家族1A（Ras association domain family 1A,RASSF1A）基因启动子区异常甲基化，并探讨其与卵巢癌的关系。方法 收集新鲜的卵巢癌组织及其对应的血清标本67例，采用半巢式甲基化特异性PCR技术分别检测肿瘤组织DNA和血清游离DNA中RASSF1A基因启动子异常甲基化情况。结果 卵巢癌患者血清和癌组织中RASSF1A基因甲基化的检出率分别为28.4%和40.3%。卵巢良性肿瘤组织和血清以及健康志愿者血清中均未发生RASSF1A基因甲基化。癌组织中RASSF1A基因的甲基化状况与血清中出现RASSF1A基因甲基化关系密切（P＜0.01）；卵巢癌患者血清和癌组织中RASSF1A基因的甲基化改变与肿瘤的临床分期、细胞分化程度、组织学类型无明显相关性（P＞0.05）；与淋巴结转移密切相关（P＜0.01）。结论 检测血清DNA 的RASSF1A基因异常甲基化有可能成为辅助卵巢癌诊断的有效方法之一。

【关键词】  卵巢肿瘤 基因 RASSF1A DNA甲基化

    LI Qirong1,　LIU Peishu1，　ZHANG Yan2

    (Department of Gynecology and Obstetrics, 1. Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012,   China;

    2. Weifang People′s Hospital, Weifang 261041,  Shandong, China)

    Abstract: Objective  To explore the correlation between hypermethylation of the RASSF1A gene and ovarian cancer. Method  Sixtyseven tissue samples and their corresponding serum samples from ovarian cancer patients were collected for hypermethylation measurement by seminested methylationspecific PCR(MSP). Results  Hypermethylation of the RASSF1A presented in 28.4%(19/67) of the cancer serum samples and 40.3%(27/67) of the cancer tissues. No benign ovarian disease tissues or serums were methylated. Hypermethylation of the RASSF1A was not found in serum samples from healthy volunteers. There was a statistical association between hypermethylation of the  RASSF1A in serums and in cancer tissues (P＜0.01). Hypermethylation of the RASSF1A in serum and the corresponding cancer tissues were not significantly correlated with the clinical stage, histological cell types, or degree of cell differentiation of the tumor(P＞0.05); but it was strongly correlated with lymph node metastasis(P＜0.01). Conclusion  Hypermethylation of the RASSF1A  may be a useful marker in the auxiliary diagnosis of ovarian cancer .

    Key words: Ovarian tumor； Gene， RASSF1A； DNA methylation

    卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，卵巢癌的死亡率居妇科肿瘤首位。70%的患者发现时已是晚期（Ⅲ和Ⅳ期），虽经积极治疗，5年存活率也仅为15% 20%；若早期（Ⅰ期）发现，5年存活率可达77% 87%，若为分化良好的Ⅰ期患者，5年存活率可达到94%［1］。因此，提高生存率的关键是早期诊断。近年，检测肿瘤患者外周血中肿瘤特异性DNA改变为肿瘤的早期诊断和监控提供了一种新的手段。为此，我们利用半巢式甲基化特异性PCR技术（seminested methylationspecific PCR，MSP）检测卵巢癌患者组织和血清中RASSF1A基因的甲基化状况，分析其与卵巢癌发生、发展及临床病理特征的关系。

 1  资料与方法

    1.1  临床标本收集  收集了2004年5月至2006年6月间在齐鲁医院妇产科手术治疗的67例卵巢癌患者，36 89岁，中位年龄52岁。所有患者均经病理证实，其中浆液性17例，粘液性12例，子宫内膜样25例，透明细胞癌7例，未分化癌6例。按2000年FIGO分期标准，Ⅰ期7例、Ⅱ期13例，Ⅲ期38例、Ⅳ期9例。对照组为40例卵巢良性肿瘤患者（浆液性囊腺瘤24例，粘液性囊腺瘤16例，中位年龄43岁）和20例健康志愿者。组织标本为术中所取新鲜标本，血标本取自术前1d空腹外周静脉血。所有患者术前均未进行任何治疗。同时收集了35例卵巢癌术后1周未行化疗或放疗患者的血清。血标本2?500×g离心20?min，吸取上层血清置-80?℃冰箱中保存；术中收集的相应的肿瘤组织标本-80?℃保存。

    1.2  DNA提取

    1.2.1  肿瘤组织DNA的提取  取约0.5?g组织，剪碎，加入200?μL裂解缓冲液（10?mmol/L TrisHcl pH 8.0，0.1?mol/L EDTA pH 8.0，0.5%SDS），再加入蛋白酶K（20?mg/mL）至终浓度0.5?mg/ml，混匀，50?℃水浴1 2?h；待完全水解后加RNA酶（终浓度0.25 0.3?μｇ/μL）37?℃孵育1?h；加等体积的饱和酚，振荡，8?000?r/min 离心30?s，吸取上清至另一EP管中，然后加入等体积氯仿（三氯甲烷），振荡，8?000?r/min 离心30?s，吸取上清至另一EP管中，加1/10体积3?mol/L乙酸钠（pH 5.2），2倍体积无水乙醇沉淀DNA，然后用无水乙醇洗涤DNA，室温干燥，加适量双蒸水溶解，测A260/A280比值并定量。

    1.2.2  血清中DNA的提取  参考文献［2］取1.0?mL血清，加入约10?mL DNA缓冲抽提液（140?mmol/L Tris，140?mmol/L EDTA，0.57%SDS），加入蛋白酶K至终浓度为100?μｇ/mL，放入37?℃水浴振荡过夜，然后用酚-氯仿抽提法提取DNA。

    1.3  RASSF1A基因异常甲基化检测

    1.3.1  亚硫酸氢钠修饰基因组DNA  按Herman等［3］的方法进行。

    1.3.2  半巢式MSP  第1轮PCR扩增引物MU379(5′GTTTTGGTAGTTTAATGAGTTTAGGTTTTTT)和ML730［4］（5′ACCCTCTTCCTCTAACACAATAAAACTAA

    CC）。反应体系50?μL：亚硫酸氢钠处理的DNA模板2?μL，双蒸水36.2?μL，10×buffer 5?μL，MgCl24?μL，Taq聚合酶0.3?μL，dNTP:0.5?μL，引物MU379［4］、引物ML730各1?μL。反应条件；95?℃ 5?min变性；95?℃ 15?s，55?℃ 15?s，74?℃ 30?s，共20循环；72?℃ 7?min。取第1轮PCR反应产物1/50用引物MU379和引物ML561［4］（5′CCCCACAATCCCTACACCCAAAT）进行第2轮扩增, 除为30循环外，反应体系及条件同上。

    1.3.3  内切酶分析  取上述PCR产物，加入反应体系：特异性内切酶TaqⅠ1?μL，10×TaqⅠbuffer 2?μL，加双蒸水至20?μL，65?℃酶切2?h。结束后将酶切产物在2.5%琼脂糖凝胶上电泳，紫外凝胶成像系统观察分析结果，见图1。

    1.4  统计学处理  采用χ2检验。

    2  结  果

    2.1  肿瘤组织及血清中RASSF1A基因甲基化改变  见表1。由表1可见，卵巢癌组织中RASSF1A基因甲基化率与良性卵巢肿瘤组织中RASSF1A基因甲基化率比较，差异有统计学意义（Ｐ＜0.01）。卵巢癌患者血清中RASSF1A基因甲基化率与对照组中RASSF1A基因甲基化率比较，差异有统计学意义（Ｐ＜0.01）。卵巢癌患者术前血清与术后1周血清中RASSF1A基因甲基化率相比，差异有统计学意义（Ｐ＜0.01）。

    2.2  卵巢癌患者组织和血清中RASSF1A基因甲基化的相关关系  27例癌组织中发生RASSF1A基因甲基化的患者的血清标本中，有19例检测到了RASSF1A基因甲基化；卵巢癌组织中未检测到RASSF1A基因甲基化的患者，其血清中同样未检测到RASSF1A基因甲基化。卵巢癌组织中RASSF1A基因甲基化状况与血清中是否出现RASSF1A基因甲基化关系密切（Ｐ＜0.01）。

 2.3  血清和癌组织中RASSF1A基因甲基化改变与临床病理参数的关系  见表2。由表2可见，血清和癌组织中RASSF1A基因甲基化与FIGO分期、组织学类型、细胞分化程度无明显相关性（Ｐ＞0.05）；而血清和癌组织中RASSF1A基因甲基化与淋巴结转移关系密切（Ｐ＜0.01）。

    3  讨  论

    研究非侵入性肿瘤检测及筛选方法的肿瘤特异性标志物,是临床肿瘤研究的重点,肿瘤患者血液循环中游离DNA的水平显著高于正常人［5］.癌症患者血浆/血清中含量丰富的DNA主要来自于肿瘤细胞坏死和凋亡［6］，因此，肿瘤患者外周血血清中的DNA可用于检测肿瘤特异性DNA的改变。然而基因突变、杂合性丢失等,在肿瘤演进中存在随机的、个体化的特点,尚难以在其中找到共性的、适用于所有肿瘤或同类肿瘤的标志物,有其局限性的一面；相对而言,异常甲基化在肿瘤中属于普遍现象。最近的研究发现［712］，多种肿瘤已在血清/血浆、肿瘤累及器官相关的体液中检测到肿瘤组织中存在的肿瘤相关基因的启动子异常甲基化，为癌症的诊断提供了一种新的途径。

    RASSF1A基因在恶性肿瘤中有频繁的甲基化, 被广泛应用于肿瘤表遗传学研究,并探讨其在恶性肿瘤的早期诊断、筛查及预后评估中的临床应用价值［1315］。在小细胞型肺癌患者痰液中、肾癌患者尿液中、乳腺癌患者血浆中等,均可检测到RASSF1A基因异常甲基化。体液检测RASSF1A基因异常甲基化有希望成为肿瘤筛选的诊断方法［16］。

    本研究中，67例卵巢癌患者的癌组织中RASSF1A基因甲基化的检出率是 40.3%，而40例良性肿瘤组织中RASSF1A基因均未发生甲基化。该结果表明, RASSF1A基因启动子区甲基化与卵巢上皮性恶性肿瘤的发生关系密切, RASSF1A基因可能为卵巢癌发生的重要相关抑癌基因,其改变以基因的异常甲基化为主, 可能是RASSF1A基因启动子区的异常甲基化导致该基因表达失活,进而促进了肿瘤的发生，且这种甲基化只发生在癌组织中，为肿瘤特异性的改变。卵巢癌患者相应的血清中RASSF1A基因甲基化的检出率是28.4%，而对照组血清中的检出率为0；且血清中出现RASSF1A基因甲基化的19例患者均是在组织中出现RASSF1A基因甲基化的患者，表明血清中RASSF1A基因甲基化的检测，对于卵巢良恶性肿瘤的诊断和鉴别诊断具有一定的临床意义。本研究结果显示，RASSF1A基因甲基化与卵巢癌患者的临床分期无关，表明RASSF1A基因甲基化是卵巢癌发生发展中的早期事件，检测血清中RASSF1A基因甲基化可用于卵巢癌的早期诊断及筛查。尽管本研究结果证实RASSF1A基因甲基化与细胞分化程度无关，但是随着细胞分化程度的下降，RASSF1A基因甲基化检出率升高。本研究结果还证实，RASSF1A基因甲基化与淋巴结转移密切相关，表明RASSF1A基因甲基化在卵巢癌的发生发展中起着重要的作用，可能对患者的预后综合评价有一定的指导意义。本研究还收集检测了35例卵巢癌患者术后1周的血清，与术前血清进行对照。35例术后血清中RASSF1A基因甲基化的检出率（5.7%，2/35）较术前血清中RASSF1A基因甲基化的检出率（28.4%，19/67）明显下降，有统计学意义。因此，检测术后血清中RASSF1A基因甲基化水平可用于评价手术效果和监测术后复发。

    综上所述,RASSF1A 基因的甲基化与卵巢癌的发生发展密切相关,该基因甲基化可能是参与卵巢细胞癌变的重要机制之一。RASSF1A 基因在肿瘤发生中的具体机制及与其它癌基因、抑癌基因的关系有待于进一步研究。RASSF1A 基因有望成为卵巢癌发生的敏感标志物,并用于肿瘤的早期诊断及预后分析。

【参考文献】  ［1］ Vergote I, De Brabante J, Fyles A, et al. Prognostic importance of degree of differentiation and cyst rupture in stage Ⅰinvasive epithelial ovarian carcinoma［J］. Lancet， 2001, 357(9251):176182.

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