电离辐射对胶质瘤C6细胞垂体瘤转化基因的影响

    作者：戴如飞，姜 平，蔡军，刘宁，骆 慧，闫志海，阎 超    作者单位：徐州医学院第二附属医院，江苏 徐州 221006

    【摘要】  ［目的］ 探讨不同时间点电离辐射对胶质瘤C6细胞垂体瘤转化基因（PTTG）表达的影响。［方法］ 胶质瘤C6细胞用10Gy剂量X射线照射，逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测照射前、照射后4h、8h、12h、24h、48h、72h PTTGmRNA的表达，免疫细胞化学检测PTTG蛋白表达。［结果］ PTTG mRNA及其蛋白的表达在X射线照射后4h即开始下降，12h下降最明显，24h开始回升，72h恢复正常。［结论］ 电离辐射可以显著影响胶质瘤细胞PTTG的转录和翻译；机体内存在对电离辐射导致的PTTG损伤的修复系统。

    【关键词】  放疗

    放疗是目前胶质瘤治疗的主要手段之一，研究已经证实X射线可以影响肿瘤多种基因的表达，通过基因对细胞周期的调控而调节肿瘤细胞的生长。垂体瘤转化基因（pituitary tumor transforming gene，PTTG）是一种促进肿瘤细胞生长的基因，我们已经证实不同剂量的X射线能够以量效的方式影响PTTG的表达，本研究将探讨同一剂量的X射线在不同时间点对PTTGmRNA及其蛋白的表达，进一步观察电离辐射对胶质瘤C6细胞PTTG表达的影响。

    1   材料与方法

    1.1   一般资料

    胶质瘤C6细胞（中国科学研究院上海研究所），DNTP、TapDNA聚合酶、Oligo(dT)15、AVM逆转录酶(Promega公司)，鼠抗人PTTG单克隆抗体 (Santa Cruz公司)，SP、DAB试剂盒(北京中山生物工程公司)。

    1.2   细胞培养及X射线处理

    胶质瘤C6细胞在含有10%新生小牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml DMEM培养基中，5% CO2，37℃条件下培养。细胞在24孔培养板中培养，按不同的时间分为照射前、照射4h、8h、12h、24h、48h、72h后7个组别，每组设6个复孔。对数生长期的细胞采用医用直线加速器的6MV X射线照射，剂量为10Gy，剂量率为100Mu/min，照射野为10cm×10cm，等中心照射。

    1.3   RT-PCR 检测PTTGmRNA的表达

    Trizol提取总RNA，分光光度仪测定浓度和纯度，逆转录体系合成cDNA。合成cDNA的反应体系为25μl，包括Oligo(dT)15 0.5μg，mRNA 2μg，AVM逆转录酶10U。RT-PCR 检测PTTGmRNA的表达，以β2M为内参照，设计PTTG、β2M引物序列如下（上海生物工程公司合成）：PTTG引物上游5′-CTAAGGATGGGCTGAAGCTG-3′，下游5′-CAAACAGGTGGCAATTC-3′，扩增长度496bp；β2M引物上游5′-GTAAGCAGCATCATGCA-3′，下游5′-TGGAGGAACCTGGTCA-3′，扩增长度300bp。PCR反应体系包括：逆转录混合液4μl，TapDNA聚合酶0.8μl，两种引物(50μmol/L)各1μl。PCR循环条件：变性95℃ 5min，94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，35个循环，延伸72℃ 10min；1%琼脂糖凝胶电泳，将凝胶在图象分析系统分析，计算PTTG的光密度值，以β2M的光密度值为参照,计算比值。

    1.4   免疫细胞化学检测PTTG蛋白表达

    制备细胞片，采用SP法检测PTTG蛋白表达，PTTG蛋白以肿瘤细胞中出现黄色或棕黄色为阳性表达：阳性染色细胞条件为细胞结构清晰、阳性颗粒定位好、着色与背景对比清晰。每张切片随机选取3个高倍视野(×200倍)，图象分析系统(NYD-1000)分别测得3个视野积分光密度(integrated optical density，IOD)值后取平均值。

    1.5   统计学处理

    实验数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较单因素方差分析(ANOVA)的LSD检验采用SPSS10.0统计软件处理，以P<0.05有统计学意义。

    2   结   果

    2.1   电离辐射后C6细胞形态学变化

    普通光学显微镜下观察，照射前组细胞呈圆形透明、均质、悬浮生长良好，照射组细胞内不同程度地表现有不透明物质的存在，且细胞形态也发生改变。经Giemsa染色后受照的C6细胞表现出特征性的凋亡形态改变，如细胞核固缩、核密度增高、核仁消失、核崩解、细胞变小、胞浆出现空泡等。

    2.2   不同时间点X线对胶质瘤C6细胞PTTGmRNA表达的影响

    RT-PCR检测PTTGmRNA的表达结果见表1、图1。与X射线照射前比较，PTTGmRNA的表达4h即开始下降（P<0.05），12h下降最明显（P<0.01），24h 开始回升，72h恢复正常（P>0.05）。

    2.3   不同时间点X线对胶质瘤C6细胞PTTG蛋白表达的影响

    免疫组化检测PTTG蛋白表达结果见表1，PTTG阳性细胞主要定位于肿瘤细胞的胞质，弥漫性全细胞分布，少量定位于细胞核。与X射线照射前（表1、图2）比较，4h即开始下降（P<0.01），12h下降最明显（P<0.01）（表1、图3），24h开始回升，72h恢复正常（P>0.05）。

    3   讨   论

    放疗能够影响参与肿瘤发病基因的表达而调控肿瘤细胞的增殖和凋亡。李平法等[1]发现5Gy γ射线能显著诱导人乳腺癌细胞hR24L基因的表达。盛方军等[2]证实电离辐射后AT细胞hTERT mRNA表达水平上升，闫风琴等[3]发现电离辐射可以上调小鼠EL-4淋巴瘤细胞p21蛋白表达水平，Samuni等[4]证实电离辐射能增强人淋巴母细胞瘤中p53的表达。

    脑胶质瘤是颅内常见的恶性肿瘤，目前其主要治疗手段是尽可能手术切除后配合放疗。往往同病理类型的脑胶质瘤临床放射治疗的疗效也很不一样，这被认为与脑胶质瘤放射敏感性基因有关。目前肿瘤基因治疗与放射治疗的结合已成为研究的热点。刘超英等[5]应用腺病毒为载体，取瘤内注射的方法将IL-12基因导入C57BL/6纯系小鼠Lewis肺癌细胞中,结合肿瘤的局部放疗,结果发现联合治疗组小鼠生存时间明显好于单独AdCMVIL-12组及单独照射组，并认为电离辐射与AdCMVIL-12基因联合治疗Lewis肺癌能提高疗效,两种疗法之间有协同增效的作用。田梅等[6]研究辐射诱导表达载体pEgr-hPTEN体外稳定转染联合X射线照射对胶质瘤细胞SHG-44增殖和诱导细胞凋亡的作用，结果发现稳定转染联合辐射可明显抑制肿瘤细胞增殖并诱导胞凋亡，照射后第8天稳定转染不同剂量组细胞数仅为稳定转染0Gy假照组的30.0%～50.0%和未转染0Gy假照组的7.7%～13.0%；稳定转染不同剂量照射组早期凋亡细胞百分数分别为稳定转染0Gy假照组的1.5～2.3倍、未转染照射组的1.9～4.4倍及未转染0Gy假照组的3.4～5.1倍。因而认为体外基因—放射联合作用可诱导肿瘤细胞凋亡明显增多，具有显著的肿瘤抑制。

    放射治疗与肿瘤基因治疗的结合既可提高放射治疗效果，又可解决基因治疗中面临的基因靶向转移效率低、转移基因的体内表达缺乏有效调控手段等问题。但这种方法仍有很多问题有待于解决，特别是需要进一步明确参与肿瘤发病机制各种基因对放射线的反应。

    PTTG是Pei于1997年首次从大鼠垂体腺瘤GH4细胞中发现的基因，PTTG在众多肿瘤中对加速细胞分化、加快肿瘤血管生成、促进肿瘤形成起到重要的作用。我们既往的研究表明PTTG在胶质瘤中高表达，并与胶质瘤的恶性程度、病理级别和患者的预后密切相关[7]。且证实不同剂量的X线均可显著影响PTTG的表达，且其影响水平呈现剂量依赖性。本研究应用同一剂量X线照射胶质瘤细胞观察不同时间点PTTG的反应发现，与X射线照射前比较，PTTGmRNA及蛋白表达4h即开始下降，12h下降最明显，表明放射线对该基因在转录和翻译水平均有损伤作用。

    有研究表明[8]正常情况下PTTG的表达与肿瘤的细胞周期有明显的相关性，G1/S交界期最低，S期升高，G2/M交界期最高，G1期有开始降低。细胞的辐射敏感性随着细胞周期时相而改变，在G1期有一定的抵抗性，随着向S期移行敏感性降低，在G1/S边界上敏感性上升，进入S期而下降，在S期末达到最高，进入G2和M期，细胞敏感性上升，即细胞对辐射的敏感性按M期、G2期、G1期、早S期、晚S期依次递减。我们认为电离辐射对PTTG的影响可能是通过对细胞周期的影响来实现的。

    DNA分子是生命的遗传物质基础，也是电离辐射损伤的重要靶点。细胞受到电离辐射的损伤时，DNA将产生包括碱基错配、脱嘌呤或脱嘧啶位点形成、DNA单链、双链断裂以及蛋白质交联等损伤。然而生物体内存在DNA修复系统，其中DNA损伤修复基因起着重要的作用。本研究发现放射线照射后PTTG的表达24h开始回升，72h恢复正常，表明机体内存在对电离辐射导致的PTTG损伤的修复系统。胶质瘤放疗后最大的问题是复发，我们既往的研究证实PTTG蛋白表达与胶质瘤的复发呈明显的相关性[7]，PTTG在放射线损伤后一定时间内能够修复正常，应考虑是胶质瘤复发的主要原因之一。目前对基因辐射损伤修复分子机制的认识还不十分清楚，研究认为参与辐射损伤修复的主要因素有X线交叉互补修复基因（XRCC1-XRCC9），XRCC1-XRCC9能够参与因电离辐射损伤的碱基切除修复和单链断裂修复，PTTG是否通过XRCC1-XRCC9进行修复有待于进一步研究。

    本研究初步探讨了不同时间电离辐射对PTTG表达的影响，应用放疗联合反义PTTG cDNA或PTTG RNA干扰能否延长胶质瘤患者的生存时间及延缓复发，是值得研究的课题。

【参考文献】[1] 李平法, 朱应葆, 韩云, 等. 电离辐射对人乳腺癌细胞hR24L基因表达的影响[J]. 癌变·畸变·突变, 2001, 13(2)：67-70.

[2] 盛方军, 曹建平, 朱巍, 等. 时间因素对电离辐射后AT细胞hTERT mRNA表达的影响[J]. 苏州大学学报（医学版）, 2006, 26(4):535-538.

[3] 闫风琴, 王建秋, 付士波，等. 电离辐射对小鼠EL-4淋巴瘤细胞p21蛋白表达的影响[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2006, 25(6)：514-516.

[4] Samuni AM, Kasid U, Chuang EY, et al. Effects of hypoxia on radiation responsive stress activated protein kinase, p53, and caspase 3 signals in TK6 human lymphoblatiod cells[J]. Cancer Res, 2005, 65(2):579-586.

[5] 刘超英, 许力军, 陈立, 等. 电离辐射与腺病毒介导的IL-12基因联合治疗Lewis肺癌的实验研究[J]. 中国免疫学杂志, 2006, 22（10）:918-920.

[6] 田梅, 朴春姬, 李修义, 等. 电离辐射诱导pEgr-hPTEN表达增强其体外抗肿瘤作用[J]. 吉林大学学报, 2005, 31（3）：330-333.

[7] 阎超, 戴如飞, 蔡军, 等. PTTG蛋白表达与胶质瘤病理分级及预后的相关性研究[J]. 实用肿瘤学杂志, 2007, 21（4）：301-302.