放疗对恶性肿瘤患者红细胞膜带3蛋白表达和功能的影响

　  作者：刘晓滨　吴昊　白淑芝　姜晓姝　傅国辉    作者单位：1.哈尔滨医科大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150086；2.哈尔滨医科大学附属四院，黑龙江 哈尔滨 150086；3.哈尔滨医科大学病理生理教研室，黑龙江 哈尔滨 150086；4.哈尔滨医科大学机能实验中心，黑龙江 哈尔滨 150086；5.上海第二医科大学病理生理教研室，上海 200025

　  【摘要】  ［目的］ 研究放疗对恶性肿瘤患者红细胞膜带3蛋白的表达和功能的影响。［方法］ 随机抽取8例恶性肿瘤患者并取其治疗前后的红细胞，应用Clˉ荧光探针6-甲基-3-磺丙基-1-喹啉-水化合物（SPQ）检测其治疗前后红细胞膜带3蛋白的阴离子转运活性，并通过Western blot 检定治疗前后带3蛋白表达量的变化。［结果］ 8例恶性肿瘤患者放疗后红细胞膜带3蛋白的离子转运活性均明显减弱，其中6例患者红细胞膜带3蛋白表达减少。［结论］ 带3蛋白的表达和功能与肿瘤细胞的增殖和凋亡相关。

　  【关键词】  带3蛋白　阴离子转运活性　肿瘤　放射疗法

　  Influence of Radiotherapy on Expression and Activity of Erythrocyte Membrane Band3 Protein in Patients with Malignant Tumor

    LIU Xiao-bin1, WU Hao2, BAI Shu-zhi3, et al.

    （1.The Second Affiliated Hospital in Harbin Medical University，Harbin 150086，China;

    2.The Fourth Affiliated Hospital in Harbin Medical University, Harbin 150086, China;

    3.Department of Pathophysiology in Harbin Medical University, Harbin 150086, China）

    Abstract: ［Purpose］ To investigate the influence of radiotherapy on expression and activity of red cell membrane band3 in patients with malignancy. ［Methods］ The red blood cells were collected from 8 patients with malignancy before and after therapy. The anion transport activity of band3 protein in red blood cells was measured by using a fluorescent probe SPQ and the expression of band3 was verified by Western blotting. ［Results］ Band3 protein transport activity in all 8 cases with malignancy decreased markedly after therapy. The band3 protein expression in 6 cases decreased after therapy. ［Conclusion］ The expression and activity of band3 influence on the proliferation and apoptosis of cancer cells.

    Key words: band3; anion transport activity; neoplasms; radiotherapy

    人类红细胞阴离子交换蛋白1(anion exchanger 1,AE1)，在红细胞膜蛋白电泳中处于第3条带，因此又称带3蛋白（band3），是存在于红细胞膜上的一种内在性蛋白质，占红细胞膜蛋白质总量的25%[1]。带3蛋白由911个氨基酸残基构成，14次贯穿红细胞膜，在结构上可分为三个结构域：N端胞质域、疏水性跨膜域和酸性C端域，后两者常被合称为膜段结构域 [2]。N端胞质域(43kD)形成亲水性序列，位于细胞浆内，通过锚蛋白与细胞内的骨架蛋白相连，此外，它还有带4.1蛋白、带4.2蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、磷酸果糖激酶等的作用位点，参与跨膜信息传递和其他细胞功能如细胞生长、分化、相互间识别等的调节[3]。疏水性跨膜域的生理功能是介导Cl-/HCO3-交换，在完成组织CO2运输、肺CO2排出过程中发挥重要作用，酸性C端域由32个氨基酸组成，其中含有大量携带负电荷的酸性氨基酸，其在红细胞生理状态下的结构与功能尚未完全阐明[4]。带3蛋白还具有稳定红细胞膜骨架[5]、识别和清除衰老红细胞等功能[2]。最新的研究结果表明带3蛋白可能参与细胞增殖和凋亡过程[6]，其功能亦会受放疗的影响。本研究比较了放疗前后恶性肿瘤患者红细胞膜带3蛋白表达及阴离子转运活性的差异，以其为今后肿瘤的研究与治疗提供线索。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    正常人血购自哈尔滨医科大学附属第二临床医院血库；带3蛋白单克隆抗体，DIDS（4，4′-diisothiocyanatostilbene-2，2′-disulfonic acid，4，4′-二异硫氰酸根-2，2′-二苯乙烯二磺酸钠），6-甲基-3-磺丙基-1-喹啉-水化合物（SPQ）购自Sigma公司；HEPES购自上海博奥生物科技有限公司，Western Blotting试剂盒购自Promega公司；丙烯酰胺，N-N′亚甲基双丙烯酰胺，TEMED, Ammonium Persulfate，Tris，Tween20，Sodium Dodecyl Sulfate(SDS)购自Bio-Rad公司，其他为国产分析纯。

    1.2 方 法

    1.2.1 红细胞膜带3蛋白阴离子转运测定模型

    的建立

    红细胞膜带3蛋白阴离子转运活性测定按照文献[7]报道的方法进行。正常人血（在4℃保存不超过两周）用PBS洗4次至上清无色，取20μl（2×109个/ml）红细胞悬浮进180μl溶液Ⅰ（红细胞压积与溶液Ⅰ比例为1：9）中，37℃避光孵育30min，加入SPQ，终浓度为2.85mM（对照组提前1h加DIDS, 终浓度5mM），37℃避光孵育30min，1000g离心4min，弃上清。将细胞重悬进180μl溶液Ⅱ中，再次离心弃上清。然后将细胞加入含有2ml溶液Ⅲ的比色杯中，混匀，静置5min后，用RF-540型荧光分光光度计（日本）以激发波长为320nm，发射波长为445nm，每5min计数一次，测定荧光强度的变化。

    1.2.2 恶性肿瘤患者红细胞膜带3蛋白阴离子转运活性的测定

    分别取正常人和恶性肿瘤患者全血1ml，PBS洗4次，分别取20μl(2×109个/ml)红细胞按照上述方法进行功能测定。

    1.2.3 红细胞膜血影的制备

    将正常人和恶性肿瘤患者全血用PBS洗至上清无色，分别取等量的红细胞，加入20倍体积5mM NaHCO3使红细胞溶解，同时加入对甲苯磺酰氟（PMSF, 200g/L），并在冰浴条件下搅拌5min，以12 000g离心25min后，用1ml 5mM NaHCO3重悬，以12 000g离心15min，弃上清，将终体积用5mM NaHCO3补至0.5ml。

    1.2.4 Western blot验证红细胞膜带3蛋白的表达

    取等量的红细胞血影，加入细胞裂解液，于100℃水中煮10min，然后进行9%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳条件为80V~100V，时间2.5h~3h，然后转移到PVDF膜上，用含10%BSA的TBST于37℃封闭60min后，TBST（含0.05%的Tween20）洗膜3次，每次10min。一抗（抗带3蛋白的单克隆抗体）以1∶5000的比例用TBST稀释，加入一抗，4℃过夜，用TBST洗膜3次，每次10min。加入二抗（羊抗鼠IgG）反应60min，用TBST洗膜3次，每次10min，TBS洗膜（去除Tween20）20min，用DAB显色15min，待蛋白颜色变紫，用去离子水终止显色，拍照。

    2 结 果

    2.1 正常红细胞膜带3蛋白阴离子转运活性

    氯离子（Cl-）对SPQ所发荧光具有淬灭作用，细胞内的荧光强度上升可反映Cl-出胞作用增强，即细胞阴离子转运活性增强。本实验采用的方法建立了稳定的DIDS敏感的红细胞膜带3蛋白阴离子转运模型，DIDS为带3蛋白阴离子转运抑制剂，表明荧光强度的变化来源于Clˉ转运活性的变化（图1）。随着离子转运的启动，Clˉ对SPQ所发荧光淬灭减少，红细胞内荧光强度不断上升并在40min左右达到平衡，而DIDS明显抑制了Cl-由细胞内向细胞外的转运，SPQ的荧光强度基本不变，从而排除了其他离子转运的影响。

    2.2 恶性肿瘤患者红细胞膜带3蛋白阴离子转运活性的测定

    本实验的研究对象为随机抽取的8例恶性实体瘤患者，每例患者的具体情况见表1。分别取正常成人的红细胞和8例恶性肿瘤患者放疗前后的红细胞，测定红细胞膜带3蛋白的阴离子转运活性。在启动Cl-转运活性后荧光强度均上升成曲线，取稳定荧光最大值作直方图，结果见图2。放疗后8例患者红细胞带3蛋白的阴离子转运活性均明显较放疗前弱。

    2.3 Western blot 分析

    将等量正常红细胞和8例恶性肿瘤患者红细胞在低渗条件下裂解后进行9%聚丙烯酰胺凝胶电泳。转移至PVDF膜，封闭，分别加一抗、二抗后，显色15min。图3为正常成人和8例恶性肿瘤患者放疗前后红细胞膜带3蛋白免疫印迹检定结果，从图中可以看出，与放疗前相比第1、3、4、5、6、7例肿瘤患者放疗后带3蛋白表达减弱。

    3 讨 论

    本实验首先在正常成人红细胞建立了DIDS敏感性的带3蛋白离子转运活性的测定方法，DIDS对荧光强度的抑制作用说明本实验中荧光强度的变化即可反映红细胞膜带3蛋白的Cl-转运活性。采用这一方法对正常成人红细胞和 8例实体瘤患者红细胞膜带3蛋白的表达及其离子转运活性进行了初步研究，荧光强度的测定显示恶性肿瘤患者放疗前带3蛋白对Clˉ的跨膜转运活性比正常对照组明显增强，放疗后较放疗前减弱。Western blot结果表明，部分恶性肿瘤患者放疗后带3蛋白在红细胞膜上的表达有不同程度的减少。

    阴离子交换蛋白（AE）存在于很多组织的细胞膜上，而红细胞膜AE即带3蛋白（AE1）占红细胞膜蛋白质总量的25％，并易于获得，是目前研究最充分的一种膜蛋白。近年来的研究表明带3蛋白介导Clˉ/HCO3ˉ的转运，调节细胞内pH值，与细胞增殖和凋亡密切相关[7~9]。同时有文献报道，辐射远后效应（6～10年）使红细胞膜带3蛋白表达量减少，阴离子转运功能减弱[10，11]，但放疗的急性效应对红细胞膜带3蛋白的影响，尤其是对恶性肿瘤患者的红细胞膜带3蛋白的影响尚无报道。本实验通过测定正常成人和恶性肿瘤患者放疗前后红细胞膜带3蛋白的表达，发现部分患者放疗前红细胞膜带3蛋白的表达高于正常对照，放疗后多数患者带3蛋白的表达减少。通过带3蛋白离子转运活性的测定发现放疗前明显高于正常对照，放疗后离子转运活性明显低于放疗前。恶性肿瘤患者带3蛋白离子转运活性的明显增强和放疗前后的显著变化，提示恶性肿瘤的发生、发展有可能与带3蛋白的功能和表达有关。射线对生物体作用的机制主要是对细胞核DNA生物大分子造成不可修复的损伤，从而导致细胞间期性死亡和增殖性死亡。射线在细胞膜水平上对细胞有什么影响尚未见文献报道，我们推测阴离子交换蛋白可能是肿瘤放疗的靶点之一，通过放疗等治疗癌症的手段影响阴离子交换蛋白的表达与功能，从而达到抑制肿瘤细胞增殖和扩散，促进其凋亡的疗效，这将为恶性肿瘤的深入研究提供新线索和新思路。

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